Значение протокола зависит от передачи сигналов от мембраны к ядру и не влияет напрямую на геном, как в случае с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками. Нетератогенная природа полученных из крови плюрипотентных стволовых клеток является основным преимуществом методики, что делает ее пригодной для безопасного клинического применения в различных областях регенеративной медицины. Демонстрировать процедуру доктор Энн-Катрин Шотт, руководитель проекта, и Оксана Гринакр, лаборант в моей лаборатории.
Чтобы изолировать PBMNCs, добавляют 25 миллилитров крови один к одному, разбавленной PBS, к 10 миллилитрам среды градиента плотности и центрифугируют смесь в 300 раз G в течение 30 минут. Изолируйте интерфейсный слой между плазмой и средой градиента плотности путем пипетирования. Промыть изолированные клетки пятью миллилитрами стерильного PBS и центрифугой в 300 раз G в течение 10 минут.
Повторив процедуру дважды, подсчитайте количество клеток с помощью счетной камеры. Добавьте 6 на 10 к 6-й мононуклеарной клетке в 15-миллилитровую трубку, затем выполните сшивание антител, добавив к клеткам в PBS с 1% BSA и инкубируя в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, к клеткам в PBS с 1% BSA и инкубируя в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. После сшивки замените инкубационную среду на модифицированную среду Dulbecco от Iscove, дополненную 10% FBS.
Выращивайте клетки в 15-миллилитровых полистирольных трубках, помещая их в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 8-10 дней без встряхивания. На пятый день добавьте еще один-два миллилитра Iscove's Medium, дополненный 10% FBS, к каждой 15-миллилитровой трубке. Подсчитайте культивированные клетки с помощью счетной камеры.
Затем центрифугируют клеточную суспензию приблизительно 5 на 10 к 6-й клетке в 300 раз G в течение 10 минут и аспирируют полученный супернатант стерильной пипеткой Пастера. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 90 микролитрах предварительно охлажденного PBS рН 7,2 с 0,5% BSA и двумя миллимолярами ЭДТА. Затем добавьте 80 микролитров CD-45 положительных наноразмерных магнитных шариков в клеточную суспензию и высиживая на льду в течение 15 минут.
Для промывки клеток добавьте два миллилитра буфера PBS и центрифугу в 300 раз G в течение 10 минут. Повторное суспендение клеток в 500 микролитрах буфера PBS. Промыть колонну 500 микролитрами предварительно охлажденного буфера PBS и поместить ее в магнитное поле.
Поместите клеточную суспензию на колонну и дважды промыть ее 500 микролитрами буфера PBS. Соберите клетки в Iscove's Medium, дополненное 1% BSA, и подсчитайте клетки в счетной камере. Поместите стеклянные крышки в четырехборье и покрывайте их от одного до пяти разбавленных поли-L-орнитином и двойной дистиллированной водой.
После инкубации покровных покровов при 37 градусах Цельсия в течение одного часа промыть их двойной дистиллированной водой. Медленно разморозить от 0,5 до двух миллиграммов на миллилитр ламинина и добавить его в верхнюю часть покровных прорезей. Инкубируют их при 37 градусах Цельсия в течение двух часов, затем удаляют избыток ламинина путем пипетирования и добавляют нейронную среду N2 в блюда для культивирования.
Культивировать отрицательные клетки CD-45, полученные из BD, в среде N2 на стеклянных покровах с покрытием ламинином илинитином в течение двух дней в инкубаторе с 5% углекислым газом при 37 градусах Цельсия, чтобы инициировать нейронную дифференцировку новых клеток, генерируемых BD. Затем культивируют клетки в нейронной дифференцировальной среде и помещают пластины в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 16 дней. Приготовьте фиксатор с 75 миллилитрами стерильной воды и четырьмя граммами параформальдегида.
Добавьте 10 нормальных гидроксидов натрия по мере необходимости, перемешивая до тех пор, пока раствор не очистится. Добавьте в раствор сахарозную смесь и титруйте ее до рН 7,4 с шестью обычными соляными кислотами. Доведите объем до 100 миллилитров стерильной водой.
После удаления носителя из клеточной культуры высиживают ее с предварочным фиксатором в течение 15 минут, затем выбрасывают фиксатор и промывают клетки три раза по пять минут каждая. Сразу же добавляют свежеприготовленный 0,3% раствор Тритона-Х и проницают клетки в течение пяти минут. Трижды промыть PBS и добавить блокирующий раствор PBS и 5% BSA.
Блокируйте ячейки при комнатной температуре на пластине коромысла в течение одного часа. Готовят соответствующее разведение антител в 1%BSA PBS и инкубируют клетки с антителами на коромысле в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Промывайте ячейки три раза PBS в течение пяти минут за одну стирку.
Инкубируют клетки с помощью DAPI и монтируют крышки с монтажными носителями для визуализации в микроскопе. Морфологический аспект дедифференцированных клеток BD изучали в первый, пятый и 10-й дни, показывая тенденцию постепенного исчезновения неактивированных клеток и неуклонно растущую новую популяцию клеток в активированной культуре. BD дедифференцированные клетки были небольшими и показали характеристики незрелых агранулярных клеток с меньшим количеством органелл и больших ядер с конденсированным хроматином, похожим на ЭСК.
Клетки изучали для нейроредифференцировки после культивирования в покрытых ламинином культурных блюдах в течение 30 дней. Уже через четыре дня можно было обнаружить первые нейроноподобные клетки с длинными ветвяющимися структурами. Большинство мелких сферических клеток развились в разветвленные клетки с более крупными вытянутыми формами, что подразумевает активный процесс дифференцировки в нейронные линии.
Клеточное тело и процессы клеток показали более высокую сложность, чем недифференцированные клетки, представляя высокую плотность грубых эндоплазматических щетикулума и пучков актиновых нитей. Клетки, растущие в дифференцировочных средах, часто устанавливали межклеточные контакты с участием клеточного тела, в то время как другие участвовали в клеточных процессах нейритоподобным образом. Иммунохимический анализ, проведенный с использованием специфических антител, подтвердил, что дедифференцированные клетки BD способны к редифференцировке в сторону различных нейронных линий, включая астроциты GFAP.
Эта методика позволяет создавать аутологичные нетератогенные клетки, способные к редифференцировки в клетки всех трех зародышевых слоев, открывая новые возможности в исследованиях регенеративной медицины.
