Protokolün önemi, çekirdek sinyaline membrandan dayanır ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde olduğu gibi genomu doğrudan etkilemez. Kan türevli pluripotent kök hücrelerin teratojenik olmayan doğası, tekniğin ana avantajıdır ve çeşitli rejeneratif tıp alanında güvenli klinik uygulama için uygun hale getirir. Prosedürü gösteren proje lideri Dr. Anne-Kathrin Schott ve laboratuvarımdaki laboratuvar asistanı Oksana Greenacre.
PBMNC'leri izole etmek için, PBS ile seyreltilmiş 25 mililitre bire bir kanı 10 mililitre yoğunluk gradyan ortamına ekleyin ve karışımı 30 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Plazma ve yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arayüz katmanını pipetleme ile izole edin. İzole edilmiş hücreleri beş mililitre steril PBS ve santrifüj ile 300 kez G'de 10 dakika yıkayın.
Prosedürü iki kez tekrar ettikten sonra, bir sayım odası kullanarak hücre sayısını sayın. 15 mililitrelik bir tüpe 6'ya 10 mononükleer hücre ekleyin, ardından PBS'deki hücrelere %1 BSA ile insan GPI bağlantılı membran proteinine özgü antikor ekleyerek ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçka yaparak antikor çapraz bağlama gerçekleştirin. Çapraz bağlamadan sonra, kuluçka ortamını Iscove'un %10 FBS ile desteklenmiş Modifiye Dulbecco's Medium ile değiştirin.
Hücreleri 15 mililitre polistiren tüplerde 37 santigrat derecede bir inkübatöre ve 8 ila 10 gün boyunca titremeden% 5 karbondioksite yerleştirerek büyütün. Beşinci gün, her 15 mililitrelik tüpe%10 FBS ile desteklenmiş bir ila iki mililitre iscove's Medium ekleyin. Kültürlü hücreleri bir sayım odası ile sayın.
Daha sonra yaklaşık 5'e 10 hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 300 kez G'de 6. Hücre peletini 90 mikrolitre önceden soğutulmuş pH 7.2 PBS'de %0.5 BSA ve iki milimolar EDTA ile yeniden biriktirin. Daha sonra hücre süspansiyonu içine 80 mikrolitre CD-45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuk ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Hücreleri yıkamak için, 10 dakika boyunca 300 kez G'de iki mililitre PBS tamponu ve santrifüj ekleyin. Hücreleri 500 mikrolitre PBS arabelleğine yeniden ayırın. Kolonu önceden soğutulmuş 500 mikrolitre PBS tamponu ile yıkayın ve manyetik alana yerleştirin.
Hücre süspansiyonunu kolona yerleştirin ve 500 mikrolitre PBS arabelleği ile iki kez yıkayın. Iscove's Medium'da %1 BSA ile desteklenmiş hücreleri toplayın ve sayım odasındaki hücreleri sayın. Cam kapakları dört kuyulu plakalara yerleştirin ve bir ila beş seyreltilmiş poli-L-ornitin ve çift damıtılmış su ile kaplayın.
Kapakları 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırdıktan sonra çift damıtılmış suyla yıkayın. Mililitre laminin başına 0,5 ila iki miligram yavaşça çözün ve kapakların üstüne ekleyin. İki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, sonra pipetleme ile fazla lamininleri çıkarın ve kültür yemeklerine nöronal orta N2 ekleyin.
Kültür BD türevli CD-45 negatif hücreler N2 ortamında laminin ornitin kaplı cam kapaklar üzerinde iki gün boyunca bir inkübatörde% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede yeni BD oluşturulan hücrelerin nöronal farklılaşması başlatmak için. Daha sonra, nöronal farklılaşma ortamındaki kültür hücreleri ve plakaları 37 santigrat derecede bir inkübatöre ve 16 gün boyunca% 5 karbondioksite yerleştirin. 75 mililitre steril su ve dört gram paraformaldehit ile bir fiksatif hazırlayın.
Çözelti temizleninceye kadar karıştırma ile gerektiği gibi 10 normal sodyum hidroksit ekleyin. Çözeltiye sakkaroz karışımı ekleyin ve altı normal hidroklorik asitle pH 7.4'e titratlayın. Steril su ile hacmi 100 mililitreye getirin.
Medyayı hücre kültüründen çıkardıktan sonra, 15 dakika boyunca ısıtıcı öncesi fiksatif ile kuluçkaya yatırın, ardından fiksatifi atın ve hücreleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Hemen yeni yapılmış bir %0,3 Triton-X çözeltisi ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca permeabilize edin. PBS ile üç kez yıkayın ve bir engelleme PBS ve%5 BSA çözeltisi ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında bir rocker plakasında bir saat boyunca engelleyin. %1 BSA PBS'de uygun bir antikor seyreltme hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca bir rocker plakasındaki antikorlarla kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın.
Hücreleri DAPI ile kuluçkaya yatırın ve kapakları mikroskopta görselleştirme için montaj ortamı ile monte edin. BD'ye adanmış hücrelerin morfolojik yönü ilk, beşinci ve 10. BD farklılaşmış hücreler küçüktü ve daha az organel ve ESC'lere benzer yoğun kromatinli büyük çekirdeklere sahip olgunlaşmamış agranuler hücrelerin özelliklerini gösterdi.
Hücreler, 30 gün boyunca laminin kaplı kültür yemeklerinde kültlendikten sonra nöro yeniden farklılaşma için çalışıldı. Dört gün gibi erken bir sürede, uzun dallanma yapılı ilk nöronal benzeri hücreler tespit edilebilir. Çoğu küçük küresel hücre, nöronal soylara farklılaşmaya doğru aktif bir süreç anlamına gelen daha büyük uzun şekillere sahip dallı hücrelere dönüştü.
Hücrelerin hücre gövdesi ve süreçleri, farklılaşmamış hücrelerden daha yüksek bir karmaşıklık göstererek, yüksek yoğunluklu kaba endoplazmik retikül ve aktin filament demetleri sundu. Farklılaşma medyasında büyüyen hücreler sıklıkla hücresel vücudu içeren hücreden hücreye temaslar kurarken, diğerleri hücresel süreçleri neurite benzeri bir şekilde içeriyordu. Spesifik antikorlar kullanılarak yapılan immün entrika analizi, BD adanmış hücrelerin GFAP astrositleri de dahil olmak üzere çeşitli nöronal soylara doğru yeniden farklılaşabildiğini doğruladı.
Bu teknik, her üç mikrop tabakasının hücrelerine yeniden farklılaşabilen otolog teratojenik olmayan hücreler oluşturmayı mümkün kılmakta ve rejeneratif tıp araştırmalarında yeni bir fırsat açtır.
