هذه الدراسة هي نظام بسيط ومتعدد الاستخدامات وسهل لفحص التأثيرات الضوئية الديناميكية المختلفة على الكائنات الحية الدقيقة والخلايا المختلفة. في هذا النظام ، يمكن وضع مؤشر LED في ترتيب مختلف اعتمادا على تصميم التجربة. يمكن حساب حالة مختلفة من PDT في لوحة 96 بئرا أو حتى لوحة 384 بئرا في تجربة واحدة.
يمكن استخدام هذه التقنية لعلاج التهاب القرنية الفطري الذي بسببه على مستوى العالم ، يفقد حوالي 150،000 شخص أعينهم على الرغم من العلاجات المكثفة. للبدء ، قم بقطع أربعة مصابيح LED خضراء من شريط LED ومحاذاتها مع ثلاثة آبار من لوحة 96 بئرا. قم بقياس معدل طلاقة LED عند 540 نانومتر باستخدام مقياس طاقة الضوء.
حافظ على درجة حرارة ثابتة عند 25 درجة مئوية باستخدام مروحة كهربائية تم تجميعها بجانب اللوحة أثناء التشعيع. باستخدام حلقة معقمة ، اختر مستعمرة واحدة من المبيضات البيضاء من صفيحة أجار وأضفها إلى أنبوب زجاجي معقم يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط YPD. احتضن الأنبوب عند 25 درجة مئوية بسرعة دوران تبلغ 155 دورة في الدقيقة لمدة 14 إلى 16 ساعة لزراعة ثقافة الخميرة.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها باستخدام وسيط YPD إلى قيمة OD 600 البالغة 0.5. احتضان عند 30 درجة مئوية مع دوران عند 155 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات لتحقيق مرحلة نمو السجل. كرر تخفيف ثقافة الطور الخشبي مع وسيط YPD الطازج إلى قيمة OD 600 البالغة 0.65 ، للحصول على ما يقرب من 10 مرات إلى وحدات تشكيل المستعمرة السابعة لكل ملليلتر.
في وقت واحد إعداد محلول الأسهم 4 ٪ من البنغال الوردي في 1X PBS. تصفية تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرومتر. أضف 111 ميكرولتر من محلول البنغال الوردي بنسبة 2٪ إلى ملليلتر واحد من ثقافة الطور اللوغاريت، وشارك في الزراعة في نقاط زمنية مختلفة في درجة حرارة الغرفة لفهم امتصاص RB في الخلايا.
جهاز طرد مركزي في 16 ، 100 مرة G لمدة 2 1/2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وغسل الثقافة المشتركة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من 1X PBS. بعد الغسيل ، أعد تعليق ثقافة المبيضات البيضاء في ملليلتر واحد من 1X PBS. لكل حالة ، قم بتوزيع الثقافة في ثلاثة آبار مختلفة في لوحة من 96 بئرا.
قم بمحاذاة الآبار مع صفيف LED. في المجموعات المكشوفة للضوء، قم بتشغيل المروحة الكهربائية والضوء. بعد التشعيع ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية عشرة أضعاف مرتين عن طريق أخذ 20 ميكرولتر من محلول الزراعة المشتركة من بئر واحد ، وإضافته إلى أنبوب يحتوي على 180 ميكرولتر من 1X PBS.
ثم قم بإسقاط 20 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي في ربع واحد من صفيحة أجار YPD للحصول على مستعمرات قابلة للعد على اللوحة. أظهر الفحص المجهري الفلوري تلطيخا فوريا لالمبيضات البيضاء مع البنغال الوردي تحت التألق الأحمر. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، كانت معظم الخلايا ملطخة بالبنغال الوردي ، مما يشير إلى أنها تدخل الخلايا بطريقة تعتمد على الوقت.
علاوة على ذلك ، فإن تنشيط البنغال الوردي بالضوء يولد الجذور الحرة والأكسجين الفردي في الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا. في غياب البنغال الوردي أو التشعيع ، لم يلاحظ أي موت للخلايا. تم تثبيط المبيضات البيضاء بعد تشعيع الضوء الأخضر في وجود 0.2 ٪ من البنغال الوردي بطريقة تعتمد على الجرعة الخفيفة.
من المهم أولا محاذاة لوحة 96 بئرا مع مركز LED. ثانيا ، يجب تجفيف لوحة الأجار المستخدمة جيدا لمنع اختلاط مستعمرات منفصلة. يمكن إرسال المبيضات البيضاء التي نمت على اللوحة لتحليل الجينات ، والتي يمكن أن تجيب على كيفية تأثير PDT على التعبير الجيني للخلايا.
تمهد هذه التقنيات الطريق لدراسة كيفية عمل PDT على أنواع الخلايا المختلفة ، إما الخلايا السرطانية أو البكتيريا أو الفطريات أو الفيروسات باستخدام منصة سهلة وغير مكلفة ومتعددة الاستخدامات.
