Estos protocolos permiten el estudio de la inmunidad hereditaria a los microsporidios. Las técnicas explicadas aquí pueden ayudarnos a comprender cómo se transmite la inmunidad a través de las generaciones y las moléculas que determinan la inmunidad a los microsporidios en la descendencia. C.elegans es un modelo simple y genéticamente tratable con un corto tiempo de generación para el ensayo de la herencia.
Las muchas herramientas disponibles para el gusano se pueden utilizar para descubrir los mecanismos moleculares de la inmunidad intergeneracional. Al infectar animales P0, use una dosis baja de esporas que no afecte significativamente la capacidad de los padres para producir progenie. Esto asegura que el blanqueamiento produzca suficientes animales F1 para experimentos aguas abajo Para comenzar, mueva el número requerido de placas de medio de crecimiento de nematodos no sembrados de 10 centímetros de cuatro grados Celsius a temperatura ambiente un día antes de las infecciones planificadas.
Justo antes de la infección, peletizar aproximadamente 2, 500 gusanos L1 sincronizados en un tubo de microfuge a 1, 400 veces G durante 30 segundos. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta para dejar gusanos en 50 microlitros de medios M9. Agregue un mililitro de la cepa OP50 de Escherichia coli 10X a los gusanos de 1 etapa y las esporas de N.parisii a la concentración deseada.
Como control no infectado, prepare un tubo equivalente de L1 y OP50 con un volumen de medios M9 equivalente al volumen de preparación de esporas utilizado. Mezcle la muestra de gusano L1 vórtice brevemente y placa por encima de un mililitro de gusanos en una placa mediana de crecimiento de nematodos sin semilla de 10 centímetros. Gire para asegurar que el líquido se extienda por toda la placa.
Seque las placas en un gabinete limpio con las tapas apagadas durante 10 a 20 minutos o hasta que se sequen completamente antes de incubar a 21 grados centígrados durante 72 horas. A las 72 horas después de la infección, examine las placas bajo el microscopio de disección. La placa con gusanos infectados debe contener menos embriones que las placas con gusanos no infectados.
Luego lave los gusanos de las placas en un tubo de microcentrífuga con un medio M9 de mililitros. Si quedan muchos gusanos en las placas, peletizar los gusanos por centrifugación a 1400 veces G durante 30 segundos. Retire el sobrenadante y realice lavados de placas adicionales.
Centrifugar a 1400 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente para granular los gusanos y lavar dos veces con un mililitro de medios M9 o hasta que el sobrenadante esté despejado. Vuelva a suspenderlo en un volumen final de un mililitro de medios M9 y mezcle bien mediante pipeteo. Transfiera 100 microlitros de los gusanos suspendidos a un tubo fresco y blanquee los 900 microlitros restantes para abrir los gusanos adultos y liberar embriones F1 para su análisis.
Realizar infecciones con modificaciones. como se menciona en el manuscrito. A las 72 horas después de la infección, examine las placas bajo un microscopio de disección.
La placa con gusanos ingenuos debe ser más pequeña y contener menos embriones que las placas con gusanos cebados. Luego, comience el proceso de tinción y fijación de gusanos lavándolos de las placas en un tubo de microcentrífuga usando un mililitro de 0.1% Tween 20 en medios M9. Si quedan muchos gusanos en las placas, peletice los gusanos por centrifugación a 1, 400 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente, retire el sobrenadante con una punta de pipeta y realice lavados de placa adicionales.
Después de peletizar los gusanos centrifugando durante 30 segundos a 1, 400 veces G a temperatura ambiente, lavar dos veces con un mililitro de medios M9 que contengan 0.1% Tween 20 o hasta que el sobrenadante esté claro. Retire el sobrenadante, agregue 700 microlitros de acetona y deje que los gusanos se fijen a temperatura ambiente durante 10 minutos. Peletizar estos gusanos fijos durante 30 segundos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente y dar dos lavados de un mililitro de solución salina tampón de fosfato que contiene 0.1% Tween 20.
Prepare 50 mililitros de solución de trabajo DY96, envuelva el recipiente en papel de aluminio y guárdelo en un cajón para evitar la exposición a la luz. Agregue 500 microlitros de solución de trabajo DY96 al pellet de gusano y gire durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar esta reacción durante 30 segundos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente para granular los gusanos y eliminar el sobrenadante.
Luego, agregue 15 microlitros del medio de montaje con o sin DAPI. Pipetee 10 microlitros de estos gusanos teñidos en un portaobjetos de microscopio y coloque un resbalón de cubierta sobre la parte superior. Para analizar los gusanos teñidos con DY96 montados en portaobjetos, realice imágenes utilizando el canal GFP de un microscopio de fluorescencia.
Para determinar la aptitud de las poblaciones de gusanos, use un objetivo 5X o 10X para evaluar la gravedad de más de 100 gusanos por condición. A las 72 horas después de la infección, los animales F1 fueron fijados y teñidos con DY96 para evaluar la resistencia a los microsporidios. Las poblaciones parentales infectadas y los controles no infectados se fijaron a las 72 horas posteriores a la infección y se tiñeron con DY96 para visualizar los embriones de gusano y las esporas de microsporidios.
Los animales infectados son pequeños, contienen muchas esporas de microsporidios y producen menos embriones que los controles sanos y no infectados. La evaluación de la gravedad del gusano mostró que aproximadamente el 95% de los animales no infectados produjeron descendencia, en comparación con los animales infectados, que eran menos del 80%Las cuantificaciones revelaron que aproximadamente el 90% de la población tratada con microsporidios estaba infectada, según lo determinado por el número de gusanos que contenían esporas teñidas con DY96. Las cuantificaciones de estos animales fijos revelaron que los gusanos cebados contenían significativamente más embriones que sus contrapartes ingenuas, lo que indica una mayor aptitud frente a la infección.
Fiji ImageJ se utilizó para determinar la carga de parásitos de gusanos individuales ingenuos e inmunes, que es el porcentaje del cuerpo lleno de esporas fluorescentes de N.parisii. Las cuantificaciones revelaron una reducción dramática en la carga de parásitos de los gusanos que provenían de padres infectados. Además, los cálculos del tamaño individual del gusano revelaron que los gusanos cebados tenían una ventaja de crecimiento significativa sobre los animales ingenuos frente a la infección por N.parisii.
Los estudios de imágenes revelaron que, si bien los animales ingenuos generalmente contenían múltiples esporas y varias células infectadas, los animales preparados tenían muchas menos o ninguna espora y, por lo general, no tenían esporoplasmas. Si las poblaciones de F1 no cebadas y cebadas tienen un número similar de animales grávidos e infectados, cuente el número de huevos por animal y analice el tejido infectado con ImageJ para encontrar diferencias más sutiles. Mientras que el amarillo directo 96 tiñe esporas maduras, la hibridación fluorescente in situ puede revelar esporoplasmas dentro de las células.
Esto puede mostrarle el número de células infectadas en gusanos cebados y no cebados. Estas técnicas han demostrado que la respuesta transcripcional de los padres puede ser instrumental en la inducción de la inmunidad hereditaria en la descendencia. Los investigadores ahora están investigando la naturaleza de esta inmunidad en la descendencia.
