Эти протоколы позволяют изучать наследственный иммунитет к микроспоридиям. Методы, описанные здесь, могут помочь нам понять, как иммунитет передается через поколения и молекулы, определяющие иммунитет к микроспоридиям у потомства. C.elegans - это простая и генетически поддающаяся лечению модель с коротким временем генерации для анализа наследования.
Многие инструменты, доступные для червя, могут быть использованы для раскрытия молекулярных механизмов межпоколенческого иммунитета. При заражении животных P0 используйте низкую дозу спор, которая существенно не влияет на способность родителя производить потомство. Это гарантирует, что отбеливание дает достаточное количество животных F1 для последующих экспериментов Чтобы начать, переместите необходимое количество 10-сантиметровых несеянных пластин среды роста нематоды от четырех градусов Цельсия до комнатной температуры за день до запланированных инфекций.
Непосредственно перед заражением гранулируют примерно 2 500 синхронизированных червей L1 в микрофьюжную трубку в 1 400 раз G в течение 30 секунд. Удалите супернатант кончиком пипетки, чтобы оставить червей в 50 микролитрах среды M9. Добавьте один миллилитр 10X штамма Escherichia coli OP50 к 1-ступенчатым червям и споры N.parisii до нужной концентрации.
В качестве неинфицированного контроля готовят эквивалентную трубку L1s и OP50 с объемом среды M9, эквивалентным объему используемого спорового препарата. Смешайте образец червя L1, кратковременно вихрев и нанесите пластину выше одного миллилитра червей на 10-сантиметровую несеянную пластину среды роста нематоды. Закрутите, чтобы жидкость растеклась по всей тарелке.
Высушите пластины в чистом шкафу со снятыми крышками в течение 10-20 минут или до полного высыхания перед инкубацией при 21 градусе Цельсия в течение 72 часов. Через 72 часа после заражения исследуйте пластины под рассекающим микроскопом. Пластина с инфицированными червями должна содержать меньше эмбрионов, чем пластины с неинфицированными червями.
Затем смойте червей с пластин в микроцентрифужную трубку, используя один миллилитр среды M9. Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием в 1400 раз G в течение 30 секунд. Удалите супернатант и выполните дополнительные промывки пластин.
Центрифугу при 1400 раз G в течение 30 секунд при комнатной температуре гранулируют червей и дважды промывают одним миллилитром среды M9 или до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Повторно суспендируйте его в конечном объеме в один миллилитр среды M9 и хорошо перемешайте путем пипетирования. Переложите 100 микролитров взвешенных червей в свежую трубку и отбелите оставшиеся 900 микролитров, чтобы вскрыть взрослых червей и выпустить эмбрионы F1 для тестирования.
Выполняйте инфекции с модификациями. как указано в рукописи. Через 72 часа после заражения исследуйте пластины под рассекающим микроскопом.
Пластина с наивными червями должна быть меньше и содержать меньше эмбрионов, чем пластины с праймированными червями. Затем начните процесс окрашивания и фиксации червей, смыв их с пластин в микроцентрифужную трубку, используя один миллилитр 0,1% Tween 20 в среде M9. Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием в 1, 400 раз G в течение 30 секунд при комнатной температуре, удалите супернатант с помощью наконечника пипетки и выполните дополнительные промывки пластин.
После гранулирования червей центрифугированием в течение 30 секунд при 1, 400 раз G при комнатной температуре дважды промыть одним миллилитрами среды M9, содержащей 0,1% Tween 20 или до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Удалите супернатант, добавьте 700 микролитров ацетона и оставьте червей зафиксировать при комнатной температуре на 10 минут. Гранулируют этих неподвижных червей в течение 30 секунд при 10 000 G при комнатной температуре и дают две промывки одного миллилитра фосфатного буферного физиологического раствора, содержащего 0,1% Tween 20.
Подготовьте 50 миллилитров рабочего раствора DY96, заверните контейнер в фольгу и храните его в ящике, чтобы предотвратить воздействие света. Добавьте 500 микролитров рабочего раствора DY96 к червячной грануле и вращайте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Центрифугируйте эту реакцию в течение 30 секунд при 10 000 G при комнатной температуре, чтобы гранулировать червей и удалить супернатант.
Затем добавьте 15 микролитров монтажного носителя с DAPI или без него. Пипетка 10 микролитров этих окрашенных червей на предметное стекло микроскопа и поместите крышку сверху. Чтобы проанализировать окрашенных DY96 червей, установленных на слайдах, выполните визуализацию с использованием канала GFP флуоресцентного микроскопа.
Чтобы определить пригодность популяций червей, используйте объектив 5X или 10X для анализа серьезности более 100 червей на состояние. Через 72 часа после заражения животных F1 фиксировали и окрашивали DY96 для оценки устойчивости к микроспоридиям. Инфицированные родительские популяции и неинфицированные контрольные группы были зафиксированы через 72 часа после заражения и окрашены DY96 для визуализации эмбрионов червей и спор микроспоридии.
Инфицированные животные маленькие, содержат много спор микроспоридий и производят меньше эмбрионов, чем здоровые, неинфицированные контрольные группы. Оценка червячности показала, что примерно 95% неинфицированных животных произвели потомство, по сравнению с инфицированными животными, которые были менее 80% Количественные оценки показали, что примерно 90% популяции, обработанной микроспоридиями, были инфицированы, что определяется количеством червей, содержащих споры, окрашенные DY96. Количественная оценка этих фиксированных животных показала, что праймированные черви содержали значительно больше эмбрионов, чем их наивные собратья, что указывает на большую приспособленность перед лицом инфекции.
Fiji ImageJ был использован для определения паразитарной нагрузки отдельных наивных и иммунных червей, которая представляет собой процент тела, заполненного флуоресцентными спорами N.parisii. Количественные оценки показали резкое снижение паразитарного бремени червей, которые пришли от инфицированных родителей. Кроме того, расчеты размера отдельных червей показали, что праймированные черви имели значительное преимущество в росте перед наивными животными перед лицом инфекции N.parisii.
Исследования изображений показали, что в то время как наивные животные обычно содержали несколько спор и несколько инфицированных клеток, у праймированных животных было гораздо меньше или вообще не было спор и, как правило, не было спороплазм. Если незагрунтованные и праймированные популяции F1 имеют одинаковое количество гравидных и инфицированных животных, подсчитайте количество яиц на животное и проанализируйте инфицированную ткань с помощью ImageJ, чтобы найти более тонкие различия. В то время как прямые желтые 96 пятен созревают спорами, флуоресцентная гибридизация in situ может выявить спороплазмы внутри клеток.
Это может показать вам количество инфицированных клеток у праймированных и незагрунтованных червей. Эти методы показали, что родительский транскрипционный ответ может играть важную роль в индуцировании наследственного иммунитета у потомства. В настоящее время исследователи исследуют природу этого иммунитета у потомства.
