Bu protokoller, mikrosporidiaya kalıtsal bağışıklığın incelenmesini sağlar. Burada açıklanan teknikler, bağışıklığın nesiller boyunca nasıl aktarıldığını ve yavrularda mikrosporidiaya karşı bağışıklığı belirleyen molekülleri anlamamıza yardımcı olabilir. C.elegans, kalıtımı analiz etmek için kısa bir üretim süresine sahip basit ve genetik olarak izlenebilir bir modeldir.
Solucan için mevcut birçok araç, nesiller arası bağışıklığın moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kullanılabilir. P0 hayvanlarını enfekte ederken, ebeveynin soy üretme yeteneğini önemli ölçüde etkilemeyen düşük bir spor dozu kullanın. Bu, ağartmanın aşağı akış deneyleri için yeterli F1 hayvanı vermesini sağlar Başlamak için, gerekli sayıda 10 santimetrelik tohumlanmamış nematod büyüme ortamı plakalarını, planlanan enfeksiyonlardan bir gün önce dört santigrat dereceden oda sıcaklığına taşıyın.
Enfeksiyondan hemen önce, 30 saniye boyunca 1.400 kez G'de bir mikrofüj tüpünde yaklaşık 2.500 senkronize L1 solucanı toplayın. Solucanları 50 mikrolitre M9 ortamında bırakmak için süpernatantı bir pipet ucuyla çıkarın. 1 aşamalı solucanlara bir mililitre 10X Escherichia coli suşu OP50 ve istenen konsantrasyona N.parisii sporları ekleyin.
Enfekte olmayan bir kontrol olarak, kullanılan spor preparatının hacmine eşdeğer bir M9 ortam hacmine sahip eşdeğer bir L1s ve OP50 tüpü hazırlayın. L1 solucan örneğini kısaca vorteks yaparak karıştırın ve bir mililitre solucanın üzerindeki plakayı 10 santimetrelik tohumsuz nematod büyüme orta plakasına yerleştirin. Sıvının tüm plakaya yayılmasını sağlamak için girdap.
Plakaları, kapakları kapalı temiz bir dolapta 10 ila 20 dakika veya 72 saat boyunca 21 santigrat derecede inkübe etmeden önce tamamen kuruyana kadar kurutun. Enfeksiyondan 72 saat sonra, diseksiyon mikroskobu altında plakaları inceleyin. Enfekte solucanların bulunduğu plaka, enfekte olmamış solucanların bulunduğu plakalardan daha az embriyo içermelidir.
Daha sonra solucanları plakalardan bir mililitre M9 ortamı kullanarak bir mikrosantrifüj tüpüne yıkayın. Plakalarda birçok solucan kalırsa, solucanları 30 saniye boyunca 1400 kez G'de santrifüjleme yoluyla toplayın. Süpernatantı çıkarın ve ek plaka yıkamaları yapın.
Solucanları peletlemek için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1400 kez G'de santrifüj yapın ve bir mililitre M9 ortamı ile veya süpernatant temizlenene kadar iki kez yıkayın. Bir mililitrelik M9 ortamın son hacminde tekrar askıya alın ve pipetleme ile iyice karıştırın. Asılı solucanların 100 mikrolitresini taze bir tüpe aktarın ve yetişkin solucanları açmak ve test için F1 embriyolarını serbest bırakmak için kalan 900 mikrolitreyi ağartın.
Değişikliklerle enfeksiyonları gerçekleştirin. makalede belirtildiği gibi. Enfeksiyondan 72 saat sonra, plakaları diseksiyon mikroskobu altında inceleyin.
Naif solucanlı plaka daha küçük olmalı ve astarlanmış solucanlı plakalardan daha az embriyo içermelidir. Daha sonra, solucanların boyama ve sabitleme sürecini, M9 ortamında bir mililitre% 0.1 Ara 20 kullanarak plakalardan bir mikrosantrifüj tüpüne yıkayarak başlatın. Plakalarda çok sayıda solucan kalırsa, solucanları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.400 kez G'de santrifüjleme yoluyla pelet edin, bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın ve ek plaka yıkamaları yapın.
Solucanları oda sıcaklığında 1.400 kez G'de 30 saniye santrifüj yaparak peletledikten sonra,% 0.1 Ara 20 içeren bir mililitre M9 ortamı ile veya süpernatant temizlenene kadar iki kez yıkayın. Süpernatanı çıkarın, 700 mikrolitre aseton ekleyin ve solucanları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sabitlemeye bırakın. Bu sabit solucanları oda sıcaklığında 10.000 kez G'de 30 saniye boyunca pelet edin ve% 0.1 Aradaki 20 içeren bir mililitre fosfat tampon salinin iki yıkamasını verin.
50 mililitre DY96 çalışma çözeltisi hazırlayın, kabı folyoya sarın ve ışığa maruz kalmayı önlemek için bir çekmecede saklayın. Solucan peletine 500 mikrolitre DY96 çalışma solüsyonu ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika döndürün. Solucanları peletlemek ve süpernatanı çıkarmak için bu reaksiyonu oda sıcaklığında 10.000 kez G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın.
Ardından, DAPI'li veya DAPI'siz 15 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Pipet, bu lekeli solucanların 10 mikrolitresini mikroskop üzerine kaydırır ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Slaytlara monte edilen DY96 lekeli solucanları analiz etmek için, floresan mikroskobun GFP kanalını kullanarak görüntüleme gerçekleştirin.
Solucan popülasyonlarının uygunluğunu belirlemek için, durum başına 100'den fazla solucanın yerçekimini test etmek için 5X veya 10X hedefi kullanın. Enfeksiyondan 72 saat sonra, F1 hayvanları mikrosporidia direncini değerlendirmek için DY96 ile sabitlendi ve boyandı. Enfekte ebeveyn popülasyonları ve enfekte olmayan kontroller enfeksiyondan 72 saat sonra sabitlendi ve solucan embriyolarını ve mikrosporidia sporlarını görselleştirmek için DY96 ile boyandı.
Enfekte hayvanlar küçüktür, birçok mikrosporidia sporu içerir ve sağlıklı, enfekte olmamış kontrollerden daha az embriyo üretir. Solucan yerçekiminin değerlendirilmesi, enfekte olmamış hayvanların yaklaşık% 95'inin,% 80'den az olan enfekte hayvanlara kıyasla yavru ürettiğini göstermiştir Nicelemeler, DY96 lekeli sporlar içeren solucanların sayısı ile belirlendiği gibi, mikrosporidia ile tedavi edilen popülasyonun yaklaşık% 90'ının enfekte olduğunu ortaya koymuştur. Bu sabit hayvanların nicelleştirilmesi, astarlanmış solucanların naif meslektaşlarından önemli ölçüde daha fazla embriyo içerdiğini ve enfeksiyon karşısında daha fazla uygunluk gösterdiğini ortaya koymuştur.
Fiji ImageJ, floresan N.parisii sporlarıyla dolu vücudun yüzdesi olan bireysel naif ve bağışıklık astarlanmış solucanların parazit yükünü belirlemek için kullanıldı. Nicelikler, enfekte olmuş ebeveynlerden gelen solucanların parazit yükünde çarpıcı bir azalma olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, bireysel solucan büyüklüğünün hesaplanması, astarlanmış solucanların N.parisii enfeksiyonu karşısında naif hayvanlara göre önemli bir büyüme avantajına sahip olduğunu ortaya koymuştur.
Görüntüleme çalışmaları, naif hayvanların tipik olarak birden fazla spor ve birkaç enfekte hücre içermesine rağmen, astarlanmış hayvanların çok daha az spora sahip olduğunu veya hiç sporoplazma içermediğini ortaya koymuştur. Astarlanmamış ve astarlanmış F1 popülasyonları benzer sayıda gravid ve enfekte hayvana sahipse, hayvan başına yumurta sayısını sayın ve daha ince farklılıklar bulmak için enfekte olmuş dokuyu ImageJ ile analiz edin. Doğrudan sarı 96 olgun sporları boyarken, floresan in situ hibridizasyon hücreler içindeki sporoplazmaları ortaya çıkarabilir.
Bu size astarlanmış ve astarlanmamış solucanlardaki enfekte hücrelerin sayısını gösterebilir. Bu teknikler, ebeveyn transkripsiyonel yanıtının yavrularda kalıtsal bağışıklığı indüklemede etkili olabileceğini göstermiştir. Araştırmacılar şimdi yavrularda bu bağışıklığın doğasını araştırıyorlar.
