Esses protocolos permitem o estudo da imunidade herdada à microsporidia. Técnicas explicadas aqui podem nos ajudar a entender como a imunidade é transmitida através de gerações e as moléculas que determinam imunidade à microsporidia na prole. C.elegans é um modelo simples e geneticamente tratável com um curto tempo de geração para avaliar a herança.
As muitas ferramentas disponíveis para o verme podem ser usadas para descobrir mecanismos moleculares de imunidade intergeracional. Ao infectar animais P0, use uma dose de esporo baixa que não impacte significativamente a capacidade do pai de produzir prole. Isso garante que o branqueamento produz animais F1 suficientes para experimentos a jusante Para começar, mova o número necessário de placas médias de crescimento de nematoides não semeadas de 10 centímetros de quatro graus Celsius para a temperatura ambiente um dia antes das infecções planejadas.
Pouco antes da infecção, a pelota diminuiu aproximadamente 2.500 vermes L1 sincronizados em um tubo de microfuge a 1.400 vezes G por 30 segundos. Remova o supernatante com uma ponta de pipeta para deixar vermes em 50 microliters de mídia M9. Adicione um mililitro de 10X Escherichia coli cepa OP50 aos vermes de 1 estágio, e esporos N.parisii à concentração desejada.
Como um controle não infectado, prepare um tubo equivalente de L1s e OP50 com um volume de mídia M9 equivalente ao volume de preparação de esporos utilizado. Misture a amostra de verme L1 por vórtice brevemente e placa acima de um mililitro de vermes em uma placa média de crescimento de nematoide não semeada de 10 centímetros. Gire para garantir que o líquido se espalhe por toda a placa.
Seque as placas em um armário limpo com as tampas desligada por 10 a 20 minutos ou até secar completamente antes de incubar a 21 graus Celsius por 72 horas. Às 72 horas após a infecção, examine as placas sob o microscópio dissecando. A placa com vermes infectados deve conter menos embriões do que as placas com vermes não infectados.
Em seguida, lave os vermes das placas em um tubo de microcentrifuuge usando um mililitro M9 media. Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelota os vermes por centrifugação a 1400 vezes G por 30 segundos. Remova o supernatante e realize lavagens adicionais de placas.
Centrifugar a 1400 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente para pelotar os vermes e lavar duas vezes com um mililitro de mídia M9 ou até que o supernatante esteja limpo. Suspenda-o em um volume final de uma mídia M9 mililitro e misture bem por pipetação. Transfira 100 microliters dos vermes suspensos para um tubo fresco e alvejar os 900 microliters restantes para quebrar os vermes adultos e liberar embriões de F1 para testes.
Realizar infecções com modificações. como mencionado no manuscrito. Às 72 horas após a infecção, examine as placas sob um microscópio dissecando.
A placa com vermes ingênuos deve ser menor e conter menos embriões do que as placas com vermes preparados. Em seguida, inicie o processo de coloração e fixação de vermes lavando-os das placas em um tubo de microcentrifuuge usando um mililitro de 0,1%Tween 20 em mídia M9. Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelotar os vermes por centrifugação a 1.400 vezes G durante 30 segundos em temperatura ambiente, remover o sobrenatante usando uma ponta de pipeta e realizar lavagens adicionais de placas.
Depois de pelleting os vermes por centrifugação por 30 segundos a 1.400 vezes G à temperatura ambiente, lave duas vezes com um mililitro de mídia M9 contendo 0,1% Interpol 20 ou até que o supernante esteja claro. Remova o supernatante, adicione 700 microliters de acetona e deixe os vermes para fixar à temperatura ambiente por 10 minutos. Pellule esses vermes fixos por 30 segundos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente e dê duas lavagens de um soro fisco tampão de fosfato mililitro contendo 0,1%Tween 20.
Prepare 50 mililitros de solução de trabalho DY96, enrole o recipiente em papel alumínio e armazene-o em uma gaveta para evitar a exposição à luz. Adicione 500 microliters de solução de trabalho DY96 à pelota de minhoca e gire por 30 minutos à temperatura ambiente na escuridão. Centrifugar esta reação por 30 segundos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente para pellet os vermes e remover o supernatante.
Em seguida, adicione 15 microliters do meio de montagem com ou sem DAPI. Pipeta 10 microlitros desses vermes manchados em um slide de microscópio e coloque um deslizamento de cobertura por cima. Para analisar os worms manchados de DY96 montados em slides, realize imagens usando o canal GFP de um microscópio de fluorescência.
Para determinar a aptidão das populações de vermes, use um objetivo 5X ou 10X para avaliar a gravididade de mais de 100 vermes por condição. Com 72 horas após a infecção, os animais de F1 foram fixados e manchados com DY96 para avaliar a resistência à microsporidia. Populações parentais infectadas e controles não infectados foram fixados em 72 horas após a infecção e manchados com DY96 para visualizar os embriões de vermes e esporos de microsporidia.
Animais infectados são pequenos, contêm muitos esporos de microsporidia, e produzem menos embriões do que controles saudáveis e não infectados. A avaliação da gravididade dos vermes mostrou que aproximadamente 95% dos animais não infectados produziram descendentes, em comparação com os animais infectados, que eram inferiores a 80% Quantificações revelaram que aproximadamente 90% da população tratada com microsporidia foram infectadas, conforme determinado pelo número de vermes contendo esporos manchados de DY96. Quantificações desses animais fixos revelaram que os vermes preparados continham significativamente mais embriões do que seus homólogos ingênuos, indicando maior aptidão em face da infecção.
Fiji ImageJ foi usado para determinar a carga de parasitas de vermes ingênuos e imunes individuais, que é a porcentagem do corpo preenchido com esporos fluorescentes n.parisii. Quantificações revelaram uma redução dramática da carga de parasitas de vermes que vieram de pais infectados. Além disso, os cálculos do tamanho individual do verme revelaram que os vermes preparados tinham uma vantagem significativa de crescimento sobre animais ingênuos em face da infecção por N.parisii.
Estudos de imagem revelaram que, embora animais ingênuos tipicamente contiveam múltiplos esporos e várias células infectadas, os animais preparados tinham muito menos ou nenhum esporos e normalmente não havia esporosmas. Se populações de F1 não primed e primed têm números semelhantes de animais gravid e infectados, conte o número de ovos por animal, e analise tecido infectado com ImageJ para encontrar diferenças mais sutis. Enquanto o amarelo direto 96 manchas maduras esporos, fluorescência in situ hibridização pode revelar esporosmas dentro das células.
Isso pode mostrar o número de células infectadas em vermes preparados e não-primitivos. Essas técnicas mostraram que a resposta transcricional dos pais pode ser fundamental para induzir a imunidade herdada na prole. Pesquisadores estão investigando a natureza dessa imunidade na prole.
