Questi protocolli consentono lo studio dell'immunità ereditaria ai microsporidi. Le tecniche spiegate qui possono aiutarci a capire come l'immunità viene trasmessa attraverso le generazioni e le molecole che determinano l'immunità ai microsporidi nella prole. C.elegans è un modello semplice e geneticamente trattabile con un breve tempo di generazione per l'analisi dell'ereditarietà.
I numerosi strumenti disponibili per il verme possono essere utilizzati per scoprire i meccanismi molecolari dell'immunità intergenerazionale. Quando si infettano animali P0, utilizzare una bassa dose di spore che non influisce in modo significativo sulla capacità del genitore di produrre progenie. Ciò garantisce che lo sbiancamento produca abbastanza animali F1 per gli esperimenti a valle Per iniziare, spostare il numero richiesto di piastre medie di crescita dei nematodi senza semi di 10 centimetri da quattro gradi Celsius a temperatura ambiente un giorno prima delle infezioni pianificate.
Poco prima dell'infezione, pellet giù circa 2.500 vermi L1 sincronizzati in un tubo di microfuga a 1.400 volte G per 30 secondi. Rimuovere il surnatante con una punta a pipetta per lasciare i vermi in 50 microlitri di supporti M9. Aggiungere un millilitro di 10X Escherichia coli ceppo OP50 ai vermi a 1 stadio e spore N.parisii alla concentrazione desiderata.
Come controllo non infetto, preparare un tubo equivalente di L1 e OP50 con un volume di mezzi M9 equivalente al volume di preparazione delle spore utilizzato. Mescolare il campione di verme L1 vorticando brevemente e piastra sopra un millilitro di vermi su una piastra media di crescita di nematodi senza semi di 10 centimetri. Ruotare per assicurarsi che il liquido si diffonda su tutto il piatto.
Asciugare le piastre in un armadio pulito con i coperchi spenti per 10-20 minuti o fino a completa asciugatura prima di incubare a 21 gradi Celsius per 72 ore. A 72 ore dopo l'infezione, esaminare le piastre al microscopio sezionante. La piastra con vermi infetti dovrebbe contenere meno embrioni rispetto alle placche con vermi non infetti.
Quindi lavare i vermi dalle piastre in un tubo microcentrifuga usando un mezzo M9 da un millilitro. Se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1400 volte G per 30 secondi. Rimuovere il surnatante ed eseguire ulteriori lavaggi a piastre.
Centrifugare a 1400 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi e lavare due volte con un millilitro di mezzo M9 o fino a quando il surnatante non è chiaro. Sospendetelo in un volume finale di un millilitro M9 e mescolate bene mediante pipettaggio. Trasferire 100 microlitri dei vermi sospesi in un tubo fresco e sbiancare i restanti 900 microlitri per rompere i vermi adulti e rilasciare embrioni F1 per i test.
Eseguire infezioni con modifiche. come menzionato nel manoscritto. A 72 ore dopo l'infezione, esaminare le piastre al microscopio sezionante.
Il piatto con vermi ingenui dovrebbe essere più piccolo e contenere meno embrioni rispetto alle placche con vermi innescati. Quindi, avviare il processo di colorazione e fissaggio dei vermi lavandoli dalle piastre in un tubo microcentrifuga utilizzando un millilitro di 0,1% Tween 20 in un mezzo M9. Se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1, 400 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante usando una punta di pipetta ed eseguire ulteriori lavaggi a piastre.
Dopo aver pellettato i vermi mediante centrifugazione per 30 secondi a 1.400 volte G a temperatura ambiente, lavare due volte con un millilitro di mezzo M9 contenente 0,1% Tween 20 o fino a quando il surnatante non è chiaro. Rimuovere il surnatante, aggiungere 700 microlitri di acetone e lasciare che i vermi fissino a temperatura ambiente per 10 minuti. Pellet fuori questi vermi fissi per 30 secondi a 10.000 volte G a temperatura ambiente e dare due lavaggi di un millilitro tampone fosfato salino contenente 0,1% Tween 20.
Preparare 50 millilitri di soluzione di lavoro DY96, avvolgere il contenitore in un foglio e conservarlo in un cassetto per evitare l'esposizione alla luce. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DY96 al pellet di vite senza fine e ruotare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare questa reazione per 30 secondi a 10.000 volte G a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi e rimuovere il surnatante.
Quindi, aggiungere 15 microlitri del mezzo di montaggio con o senza DAPI. Pipettare 10 microlitri di questi vermi macchiati su un vetrino per microscopio e posizionare un coperchio scivolare sopra la parte superiore. Per analizzare i vermi colorati DY96 montati su vetrini, eseguire l'imaging utilizzando il canale GFP di un microscopio a fluorescenza.
Per determinare l'idoneità delle popolazioni di vermi, utilizzare un obiettivo 5X o 10X per testare la gravidità di oltre 100 vermi per condizione. A 72 ore dall'infezione, gli animali di F1 sono stati fissati e colorati con DY96 per valutare la resistenza ai microsporidi. Le popolazioni parentali infette e i controlli non infetti sono stati fissati a 72 ore dopo l'infezione e colorati con DY96 per visualizzare gli embrioni di verme e le spore di microsporidi.
Gli animali infetti sono piccoli, contengono molte spore di microsporidi e producono meno embrioni rispetto ai controlli sani e non infetti. La valutazione della gravidità dei vermi ha mostrato che circa il 95% degli animali non infetti produceva prole, rispetto agli animali infetti, che erano inferiori all'80% Le quantificazioni hanno rivelato che circa il 90% della popolazione trattata con microsporidi era infetta, come determinato dal numero di vermi contenenti spore macchiate di DY96. Le quantificazioni di questi animali fissi hanno rivelato che i vermi innescati contenevano significativamente più embrioni rispetto alle loro controparti ingenue, indicando una maggiore idoneità di fronte all'infezione.
Fiji ImageJ è stato utilizzato per determinare il carico parassitario dei singoli vermi naïve e immuno innescati, che è la percentuale del corpo piena di spore fluorescenti N.parisii. Le quantificazioni hanno rivelato una drastica riduzione del carico parassitario dei vermi provenienti da genitori infetti. Inoltre, i calcoli delle dimensioni dei singoli vermi hanno rivelato che i vermi innescati avevano un significativo vantaggio di crescita rispetto agli animali naïve di fronte all'infezione da N.parisii.
Studi di imaging hanno rivelato che mentre gli animali naïve in genere contenevano più spore e diverse cellule infette, gli animali innescati avevano molte meno o nessuna spora e in genere nessun sporoplasma. Se le popolazioni di F1 non innescate e innescate hanno un numero simile di animali gravidi e infetti, contare il numero di uova per animale e analizzare il tessuto infetto con ImageJ per trovare differenze più sottili. Mentre il giallo diretto 96 macchie di spore mature, l'ibridazione fluorescente in situ può rivelare sporoplasmi all'interno delle cellule.
Questo può mostrarti il numero di cellule infette nei vermi innescati e non innescati. Queste tecniche hanno dimostrato che la risposta trascrizionale dei genitori può essere strumentale nell'indurre l'immunità ereditaria nella prole. I ricercatori stanno ora studiando la natura di questa immunità nella prole.
