Ces protocoles permettent l’étude de l’immunité héréditaire aux microsporidies. Les techniques expliquées ici peuvent nous aider à comprendre comment l’immunité est transmise d’une génération à l’autre et les molécules déterminant l’immunité aux microsporidies chez la progéniture. C.elegans est un modèle simple et génétiquement traitable avec un temps de génération court pour tester l’héritage.
Les nombreux outils disponibles pour le ver peuvent être utilisés pour découvrir les mécanismes moléculaires de l’immunité intergénérationnelle. Lorsque vous infectez des animaux P0, utilisez une faible dose de spores qui n’a pas d’impact significatif sur la capacité du parent à produire une progéniture. Cela garantit que le blanchiment donne suffisamment d’animaux F1 pour les expériences en aval Pour commencer, déplacez le nombre requis de plaques de milieu de croissance de nématodes non ensemencés de 10 centimètres de quatre degrés Celsius à température ambiante un jour avant les infections planifiées.
Juste avant l’infection, réduisez environ 2 500 vers L1 synchronisés dans un tube de microfuge à 1 400 fois G pendant 30 secondes. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette pour laisser les vers dans 50 microlitres de milieu M9. Ajouter un millilitre de 10X souche OP50 d’Escherichia coli aux vers à 1 stade et les spores de N.parisii à la concentration souhaitée.
Comme témoin non infecté, préparer un tube équivalent de L1 et OP50 avec un volume de milieu M9 équivalent au volume de préparation de spores utilisé. Mélanger l’échantillon de ver L1 en vortexant brièvement et plaquer au-dessus d’un millilitre de vers sur une plaque de milieu de croissance de nématode non ensemencée de 10 centimètres. Tourbillonnez pour vous assurer que le liquide se répand sur toute la plaque.
Séchez les plaques dans une armoire propre avec les couvercles enlevés pendant 10 à 20 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches avant d’incuber à 21 degrés Celsius pendant 72 heures. 72 heures après l’infection, examiner les plaques sous le microscope à dissection. La plaque avec des vers infectés doit contenir moins d’embryons que les plaques avec des vers non infectés.
Ensuite, lavez les vers des plaques dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’un média M9 millilitre. Si de nombreux vers restent sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1400 fois G pendant 30 secondes. Retirez le surnageant et effectuez des lavages de plaque supplémentaires.
Centrifuger à 1400 fois G pendant 30 secondes à température ambiante pour granuler les vers et laver deux fois avec un millilitre de milieu M9 ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Remettez-le en suspension dans un volume final d’un millilitre de média M9 et mélangez-le bien par pipetage. Transférer 100 microlitres des vers en suspension dans un tube frais et blanchir les 900 microlitres restants pour ouvrir les vers adultes et libérer les embryons F1 pour les tester.
Effectuer des infections avec des modifications. comme mentionné dans le manuscrit. 72 heures après l’infection, examiner les plaques sous un microscope à dissection.
La plaque avec des vers naïfs doit être plus petite et contenir moins d’embryons que les plaques avec des vers amorcés. Ensuite, commencez le processus de coloration et de fixation des vers en les lavant des plaques dans un tube de microcentrifugation en utilisant un millilitre de 0,1% Tween 20 dans un milieu M9. S’il reste de nombreux vers sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1 400 fois G pendant 30 secondes à température ambiante, retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et effectuez des lavages supplémentaires des plaques.
Après avoir granulé les vers par centrifugation pendant 30 secondes à 1 400 fois G à température ambiante, laver deux fois avec un millilitre de milieu M9 contenant 0,1% Tween 20 ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Retirez le surnageant, ajoutez 700 microlitres d’acétone et laissez les vers se fixer à température ambiante pendant 10 minutes. Éliminez ces vers fixes pendant 30 secondes à 10 000 fois G à température ambiante et donnez deux lavages d’une solution saline tampon phosphate millilitre contenant 0,1% Tween 20.
Préparez 50 millilitres de solution de travail DY96, enveloppez le récipient dans du papier d’aluminium et rangez-le dans un tiroir pour éviter toute exposition à la lumière. Ajouter 500 microlitres de solution de travail DY96 à la pastille de ver et faire pivoter pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger cette réaction pendant 30 secondes à 10 000 fois G à température ambiante pour granuler les vers et éliminer le surnageant.
Ensuite, ajoutez 15 microlitres du support de montage avec ou sans DAPI. Pipette 10 microlitres de ces vers colorés sur une lame de microscope et place un couvercle sur le dessus. Pour analyser les vers tachés DY96 montés sur des lames, effectuez une imagerie à l’aide du canal GFP d’un microscope à fluorescence.
Pour déterminer l’aptitude des populations de vers, utilisez un objectif 5X ou 10X pour mesurer la gravidité de plus de 100 vers par condition. 72 heures après l’infection, les animaux F1 ont été fixés et colorés avec DY96 pour évaluer la résistance aux microsporidies. Les populations parentales infectées et les témoins non infectés ont été fixés 72 heures après l’infection et colorés avec DY96 pour visualiser les embryons de vers et les spores de microsporidies.
Les animaux infectés sont petits, contiennent de nombreuses spores de microsporidies et produisent moins d’embryons que les témoins sains et non infectés. L’évaluation de la gravidité des vers a montré qu’environ 95 % des animaux non infectés ont produit une progéniture, comparativement aux animaux infectés, qui étaient inférieurs à 80 %Les quantifications ont révélé qu’environ 90 % de la population traitée par microsporidies étaient infectées, comme déterminé par le nombre de vers contenant des spores colorées par DY96. Les quantifications de ces animaux fixes ont révélé que les vers amorcés contenaient significativement plus d’embryons que leurs homologues naïfs, ce qui indique une plus grande aptitude face à l’infection.
Fiji ImageJ a été utilisé pour déterminer le fardeau parasitaire des vers naïfs et immunisés individuels, qui est le pourcentage du corps rempli de spores fluorescentes de N.parisii. Les quantifications ont révélé une réduction spectaculaire du fardeau parasitaire des vers provenant de parents infectés. En outre, les calculs de la taille individuelle des vers ont révélé que les vers amorcés avaient un avantage de croissance significatif sur les animaux naïfs face à l’infection à N.parisii.
Des études d’imagerie ont révélé que si les animaux naïfs contenaient généralement plusieurs spores et plusieurs cellules infectées, les animaux amorcés avaient beaucoup moins ou pas de spores et généralement pas de sporoplasmes. Si les populations F1 non amorcées et amorcées ont un nombre similaire d’animaux gravides et infectés, comptez le nombre d’œufs par animal et analysez les tissus infectés avec ImageJ pour trouver des différences plus subtiles. Alors que le jaune direct 96 tache les spores matures, l’hybridation in situ par fluorescence peut révéler des sporoplasmes dans les cellules.
Cela peut vous montrer le nombre de cellules infectées dans les vers amorcés et non amorcés. Ces techniques ont montré que la réponse transcriptionnelle parentale peut jouer un rôle déterminant dans l’induction de l’immunité héréditaire chez la progéniture. Les chercheurs étudient maintenant la nature de cette immunité chez la progéniture.
