이러한 프로토콜은 microsporidia에 대한 유전 된 면역의 연구를 가능하게합니다. 여기에 설명 된 기술은 면역이 세대에 걸쳐 어떻게 전달되는지, 그리고 자손의 미세 스포리디아에 대한 면역을 결정하는 분자를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. C.elegans는 상속을 분석하기위한 짧은 생성 시간을 가진 간단하고 유전적으로 다루기 쉬운 모델입니다.
웜에 사용할 수있는 많은 도구는 세대 간 면역의 분자 메커니즘을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. P0 동물을 감염시킬 때, 자손을 생산하는 부모의 능력에 큰 영향을 미치지 않는 낮은 포자 용량을 사용하십시오. 이것은 표백이 하류 실험을위한 충분한 F1 동물을 산출한다는 것을 보장한다 시작하기 위해, 계획된 감염 하루 전에 섭씨 4도에서 실온으로 필요한 수의 10 센티미터의 씨를 뿌리지 않은 선충류 성장 배지 플레이트를 이동시킨다.
감염 직전에, 약 2, 500개의 동기화된 L1 웜을 마이크로퍼지 튜브에서 1, 400배 G에서 30초 동안 펠릿 다운시킨다. 피펫 팁으로 상층액을 제거하여 50 마이크로 리터의 M9 배지에 웜을 남겨 둡니다. 10X 에스케리치아 콜라이 균주 OP50 1밀리리터를 1단계 웜에 첨가하고, N.parisii 포자를 원하는 농도로 첨가한다.
감염되지 않은 대조군으로서, 사용된 포자 제제의 부피와 동등한 M9 배지의 부피를 갖는 L1s 및 OP50의 동등한 튜브를 준비한다. L1 웜 샘플을 간단히 볼텍싱하여 혼합하고, 1밀리리터의 웜 위에 플레이트를 10센티미터 미시드된 선충류 성장 배지 플레이트 상에 올려 놓는다. 액체가 접시 전체에 퍼지도록 소용돌이치십시오.
뚜껑을 떼어 낸 깨끗한 캐비닛에서 플레이트를 10 ~ 20 분 동안 또는 완전히 건조 될 때까지 건조한 다음 섭씨 21도에서 72 시간 동안 배양하십시오. 감염 후 72 시간에 해부 현미경으로 플레이트를 검사하십시오. 감염된 웜이있는 플레이트에는 감염되지 않은 웜이있는 플레이트보다 배아가 적어야합니다.
그런 다음 플레이트에서 웜을 1 밀리리터 M9 배지를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브로 씻어냅니다. 많은 웜이 플레이트에 남아 있으면 1400 배 G에서 30 초 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화하십시오. 상층액을 제거하고 추가 플레이트 세척을 수행하십시오.
실온에서 30초 동안 1400배 G에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 1밀리리터의 M9 배지로 또는 상층액이 맑을 때까지 두 번 세척한다. 1 밀리리터 M9 매체의 최종 볼륨에 다시 일시 중단하고 피펫팅으로 잘 혼합하십시오. 부유 한 웜 100 마이크로 리터를 신선한 튜브로 옮기고 나머지 900 마이크로 리터를 표백하여 성인 웜을 부수고 테스트를 위해 F1 배아를 방출합니다.
수정으로 감염을 수행하십시오. 원고에서 언급했듯이. 감염 후 72 시간에 해부 현미경으로 플레이트를 검사하십시오.
순진한 웜이있는 판은 프라이밍 된 웜이있는 플레이트보다 작고 배아가 적어야합니다. 그런 다음 M9 배지에서 0.1 % Tween 20 밀리리터의 1 밀리리터를 사용하여 플레이트를 마이크로 원심분리 튜브로 세척하여 웜의 염색 및 고정 과정을 시작하십시오. 많은 웜이 플레이트에 남아 있으면 실온에서 30 초 동안 1, 400 배 G에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하고 추가 플레이트 세척을 수행하십시오.
실온에서 1, 400 배 G에서 30 초 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화 한 후, 0.1 % Tween 20을 함유 한 M9 배지 1 밀리리터로 2 회 또는 상층액이 맑을 때까지 세척하십시오. 상층액을 제거하고 700 마이크로 리터의 아세톤을 첨가 한 다음 웜을 실온에서 10 분 동안 고정시킵니다. 이들 고정된 웜을 실온에서 10, 000배 G에서 30초 동안 펠릿화하고, 0.1%Tween 20을 함유하는 1밀리리터 인산염 완충 식염수의 2회 세척을 수득하였다.
50 밀리리터의 DY96 작업 용액을 준비하고 용기를 호일에 싸서 서랍에 보관하여 빛에 노출되지 않도록하십시오. 웜 펠릿에 500 마이크로 리터의 DY96 작업 용액을 넣고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 회전하십시오. 이 반응물을 실온에서 10, 000배 G에서 30초 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 상층액을 제거하였다.
그런 다음 DAPI가 있거나없는 장착 매체 15 마이크로 리터를 추가하십시오. 이 얼룩진 웜 10 마이크로 리터를 현미경 슬라이드에 피펫하고 덮개 슬립을 상단에 놓습니다. 슬라이드에 장착된 DY96 염색된 웜을 분석하려면 형광 현미경의 GFP 채널을 사용하여 이미징을 수행합니다.
웜 집단의 적합성을 결정하려면 5X 또는 10X 목표를 사용하여 조건 당 100 개 이상의 웜의 중력을 분석하십시오. 감염 후 72시간에, F1 동물을 고정시키고, 미세스포리디아 내성을 평가하기 위해 DY96으로 염색하였다. 감염된 부모 집단 및 감염되지 않은 대조군을 감염 후 72시간에 고정시키고, DY96으로 염색하여 웜 배아 및 미세스포자를 시각화하였다.
감염된 동물은 작고, 많은 미세 스포자를 함유하고, 건강하고 감염되지 않은 대조군보다 적은 배아를 생산합니다. 웜 중력 평가에 따르면 감염되지 않은 동물의 약 95 %가 감염된 동물과 비교하여 자손을 생산했으며, 이는 80 % 미만이었습니다.정량화에 따르면 DY96 염색 포자를 함유 한 웜의 수에 따라 미세 스포리디아 처리 된 인구의 약 90 %가 감염되었음을 알 수 있습니다. 이 고정 된 동물의 정량화에 따르면 프라이밍 된 웜은 순진한 동물보다 훨씬 많은 배아를 함유하고 있으며, 이는 감염에 직면했을 때 더 큰 적합성을 나타냅니다.
피지 ImageJ는 형광 N.parisii 포자로 채워진 신체의 비율 인 개별 순진하고 면역 프라이밍 된 웜의 기생충 부담을 결정하는 데 사용되었습니다. 정량화는 감염된 부모에게서 온 웜의 기생충 부담을 극적으로 줄인 것으로 나타났습니다. 또한, 개별 웜 크기의 계산은 프라이밍 된 웜이 N.parisii 감염에 직면하여 순진한 동물에 비해 상당한 성장 이점을 가지고 있음을 보여주었습니다.
이미징 연구에 따르면 순진한 동물은 일반적으로 여러 포자와 여러 개의 감염된 세포를 포함하고 있지만, 프라이밍 된 동물은 포자가 훨씬 적거나 전혀 없으며 일반적으로 스포로 플라즈마가 없었습니다. 프라이밍되지 않은 F1 개체군과 프라이밍되지 않은 F1 개체군이 비슷한 수의 gravid 및 감염된 동물을 가지고 있다면, 동물 당 계란의 수를 계산하고, ImageJ로 감염된 조직을 분석하여보다 미묘한 차이를 찾으십시오. 직접적인 황색 96 염색은 성숙한 포자를 염색하는 반면, 계내 혼성화에서의 형광은 세포 내의 스포로 플라즈마를 나타낼 수 있다.
이것은 프라이밍 된 웜과 프라이밍되지 않은 웜에서 감염된 세포의 수를 보여줄 수 있습니다. 이러한 기술은 부모의 전사 반응이 자손의 유전 된 면역을 유도하는 데 도움이 될 수 있음을 보여주었습니다. 연구자들은 현재 자손에서이 면역의 본질을 조사하고 있습니다.
