これらのプロトコルは、微胞子虫に対する遺伝性免疫の研究を可能にする。ここで説明する技術は、免疫が世代を超えてどのように伝達されるか、および子孫の微胞子虫に対する免疫を決定する分子を理解するのに役立ちます。C.elegansは、遺伝をアッセイするための短い生成時間を持つシンプルで遺伝的に扱いやすいモデルです。
ワームに利用可能な多くのツールは、世代間免疫の分子メカニズムを明らかにするために使用することができます。P0動物に感染するときは、親の子孫の能力に有意に影響を及ぼさない低胞子用量を使用してください。これにより、漂白により下流の実験に十分なF1動物が得られることが保証されます 開始するには、計画された感染の1日前に、必要な数の10センチメートルの播種されていない線虫増殖培地プレートを摂氏4度から室温に移動します。
感染の直前に、マイクロフュージチューブ内の約2,500匹の同期L1ワームを1,400倍のGで30秒間ペレットダウンした。上清をピペットチップで取り除き、50マイクロリットルのM9培地にワームを残します。10倍大腸菌OP50株を1ミリリットルを1段階のワームに加え、N.parisii胞子を所望の濃度にする。
非感染対照として、使用した胞子調製物の体積と同等の量のM9培地を有するL1sおよびOP50の同等のチューブを調製する。L1ワームサンプルを短時間ボルテックスして混合し、1ミリリットル以上のワームを10センチメートルの播種されていない線虫増殖培地プレート上にプレートします。液体がプレート全体に広がるように渦巻きます。
蓋を外した状態でプレートを清潔なキャビネットで10〜20分間乾燥させるか、完全に乾くまで乾燥させてから、摂氏21度で72時間インキュベートします。感染後72時間で、解剖顕微鏡下でプレートを調べる。感染したワームのプレートは、感染していないワームのプレートよりも胚が少ないはずです。
その後、1ミリリットルのM9培地を使用して、プレートからワームをマイクロ遠心チューブに洗い流します。プレート上に多くのワームが残っている場合は、1400倍Gで30秒間遠心分離してワームをペレット化する。上清を除去し、追加のプレート洗浄を行う。
1400倍Gで室温で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、1ミリリットルのM9培地で、または上清が透明になるまで2回洗浄する。1ミリリットルのM9メディアの最終容量に再懸濁し、ピでよく混ぜる。100マイクロリットルの懸濁したワームを新鮮なチューブに移し、残りの900マイクロリットルを漂白して成虫を分解し、試験のためにF1胚を放出する。
変更を加えて感染を実行します。原稿で述べたように。感染後72時間で、解剖顕微鏡下でプレートを検査する。
素朴な虫のプレートは、プライミングされたワームのプレートよりも小さく、胚が少ないはずです。次に、M9培地中の0.1%Tween 20の1ミリリットルを使用してプレートからマイクロ遠心チューブにそれらを洗い流すことによって、ワームの染色および固定プロセスを開始する。プレート上に多くのワームが残っている場合は、室温で30秒間、1,400倍Gで遠心分離してワームをペレット化し、ピペットチップを用いて上清を除去し、追加のプレート洗浄を行う。
室温で1,400倍Gで30秒間遠心分離してワームをペレット化した後、0.1%Tween 20を含む1ミリリットルのM9培地で2回、または上清が透明になるまで洗浄する。上清を取り除き、アセトン700マイクロリットルを加え、ワームを室温で10分間固定したままにする。これらの固定ワームを室温で10,000倍Gで30秒間ペレットアウトし、0.1%Tween 20を含む生理食塩水に1ミリリットルのリン酸緩衝液を2回洗浄して得た。
50ミリリットルのDY96作業溶液を準備し、容器をホイルで包み、引き出しに保管して光への暴露を防ぎます。500マイクロリットルのDY96作業溶液をワームペレットに加え、暗闇の中で室温で30分間回転させる。この反応物を室温で10,000倍Gで30秒間遠心分離し、ワームをペレット化し、上清を除去した。
次いで、DAPIの有無にかかわらず15マイクロリットルの封入培地を添加する。これらの染色されたワームの10マイクロリットルを顕微鏡スライド上にピペットし、その上にカバースリップを置きます。スライドに装着されたDY96染色ワームを分析するには、蛍光顕微鏡のGFPチャネルを用いてイメージングを行う。
ワーム集団の適合性を判断するには、5 倍または 10 倍の目標を使用して、条件ごとに 100 個を超えるワームの重力をアッセイします。感染後72時間で、F1動物を固定し、DY96で染色して、微胞子虫耐性を評価した。感染した親集団および非感染対照を感染後72時間で固定し、DY96で染色して、ワーム胚および微胞子虫胞子を視覚化した。
感染した動物は小さく、多くの微胞子虫胞子を含み、健康な非感染対照よりも少ない胚を産生する。ワームの重症性の評価は、80%未満であった感染動物と比較して、非感染動物の約95%が子孫を産生することを示した定量化は、DY96染色胞子を含むワームの数によって決定されるように、微胞子虫処理集団の約90%が感染していたことを明らかにした。これらの固定動物の定量化は、プライミングされたワームがそれらの素朴な対応物よりも有意に多くの胚を含むことを明らかにしました、そして感染に直面してより大きな適応性を示しました。
フィジーImageJは、蛍光N.parisii胞子で満たされた体の割合である個々の素朴で免疫プライミングワームの寄生虫負担を決定するために使用されました。定量化は、感染した両親から来たワームの寄生虫の負担の劇的な減少を明らかにした。さらに、個々のワームサイズの計算により、N.parisii感染に直面して、プライムワームが素朴な動物よりも有意な成長優位性を有することが明らかになった。
画像化研究は、素朴な動物が典型的には複数の胞子といくつかの感染細胞を含む一方で、プライミングされた動物は胞子がはるかに少ないか全くなく、典型的には胞子質を持たないことを明らかにした。プライミングされていないF1集団とプライミングされたF1集団のグラビッド動物と感染動物の数が同程度である場合、動物あたりの卵の数を数え、ImageJで感染組織を分析してより微妙な違いを見つけます。黄色96は成熟した胞子を直接染色するが、蛍光in situハイブリダイゼーションは細胞内のスポロプラズムを明らかにすることができる。
これは、プライミングされたワームとプライミングされていないワームの感染細胞の数を示すことができます。これらの技術は、親の転写応答が子孫の遺伝性免疫を誘導するのに有益であり得ることを示している。研究者は現在、子孫のこの免疫の性質を調査しています。
