تمكن هذه البروتوكولات من دراسة المناعة الموروثة ضد الميكروسبوريديا. يمكن أن تساعدنا التقنيات الموضحة هنا على فهم كيفية انتقال المناعة عبر الأجيال والجزيئات التي تحدد المناعة ضد microsporidia في النسل. C.elegans هو نموذج بسيط وقابل للسحب وراثيا مع وقت جيل قصير لفحص الميراث.
يمكن استخدام العديد من الأدوات المتاحة للدودة للكشف عن الآليات الجزيئية للمناعة بين الأجيال. عند إصابة P0 ، استخدم جرعة بوغ منخفضة لا تؤثر بشكل كبير على قدرة الوالدين على إنتاج ذرية. وهذا يضمن أن التبييض ينتج ما يكفي من F1 للتجارب النهائية للبدء ، قم بنقل العدد المطلوب من الألواح المتوسطة لنمو الديدان الخيطية غير المزروعة التي يبلغ طولها 10 سنتيمترات من أربع درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة قبل يوم واحد من العدوى المخطط لها.
قبل الإصابة مباشرة ، قم بتكسير ما يقرب من 2،500 من ديدان L1 المتزامنة في أنبوب microfuge عند 1،400 مرة G لمدة 30 ثانية. قم بإزالة supernatant بطرف ماصة لترك الديدان في 50 ميكرولتر من وسائط M9. أضف ملليلتر واحد من سلالة الإشريكية القولونية 10X OP50 إلى الديدان ذات المرحلة الواحدة ، وجراثيم N.parisii إلى التركيز المطلوب.
كعنصر تحكم غير مصاب ، قم بإعداد أنبوب مكافئ من L1s و OP50 بحجم وسائط M9 يعادل حجم إعداد البوغ المستخدم. امزج عينة الدودة L1 عن طريق الدوامة لفترة وجيزة وطبق فوق ملليلتر واحد من الديدان على صفيحة متوسطة النمو الخيطية غير المزروعة بطول 10 سنتيمترات. قم بالتدوير لضمان انتشار السائل على اللوحة بأكملها.
جفف الأطباق في خزانة نظيفة مع إيقاف الأغطية لمدة 10 إلى 20 دقيقة أو حتى تجف تماما قبل احتضانها عند 21 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. في 72 ساعة بعد الإصابة ، افحص الألواح تحت المجهر التشريحي. يجب أن تحتوي اللوحة التي تحتوي على ديدان مصابة على أجنة أقل من الألواح التي تحتوي على ديدان غير مصابة.
ثم اغسل الديدان من الألواح في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق باستخدام وسائط M9 ملليلتر واحدة. إذا بقيت العديد من الديدان على الألواح ، فقم بتكسير الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 1400 مرة G لمدة 30 ثانية. قم بإزالة supernatant وقم بإجراء غسلات إضافية للطبق.
جهاز طرد مركزي بسرعة 1400 مرة G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان وغسلها مرتين بملليلتر واحد من وسائط M9 أو حتى يصبح السوبرنات واضحا. أعد تعليقه في حجم نهائي من وسائط M9 بملليلتر واحد واخلطه جيدا عن طريق السحب. نقل 100 ميكرولتر من الديدان العالقة إلى أنبوب جديد وتبييض ال 900 ميكرولتر المتبقية لفتح الديدان البالغة وإطلاق أجنة F1 للاختبار.
إجراء العدوى مع التعديلات. كما هو مذكور في المخطوطة. في 72 ساعة بعد الإصابة ، افحص اللوحات تحت مجهر تشريح.
يجب أن تكون اللوحة ذات الديدان الساذجة أصغر وتحتوي على أجنة أقل من الألواح ذات الديدان الجاهزة. بعد ذلك ، ابدأ عملية تلطيخ وتثبيت الديدان عن طريق غسلها من الألواح في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ملليلتر واحد من 0.1٪ Tween 20 في وسائط M9. إذا بقيت العديد من الديدان على الألواح ، فقم بتكسير الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 1،400 مرة G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة supernatant باستخدام طرف ماصة ، وقم بإجراء عمليات غسيل إضافية للصفيحة.
بعد تكوير الديدان عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 1،400 مرة من الغرام في درجة حرارة الغرفة ، اغسل مرتين بملليلتر واحد من وسائط M9 التي تحتوي على 0.1٪ Tween 20 أو حتى يصبح الخارق واضحا. قم بإزالة supernatant ، وإضافة 700 ميكرولتر من الأسيتون ، وترك الديدان لإصلاحها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإخراج هذه الديدان الثابتة لمدة 30 ثانية عند 10،000 مرة من G في درجة حرارة الغرفة وإعطاء غسلتين من محلول ملحي عازل للفوسفات ملليلتر واحد يحتوي على 0.1٪ Tween 20.
قم بإعداد 50 ملليلتر من محلول العمل DY96 ، ولف الحاوية في رقائق معدنية ، وقم بتخزينها في درج لمنع التعرض للضوء. أضف 500 ميكرولتر من محلول العمل DY96 إلى حبيبة الدودة وقم بالتدوير لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الطرد المركزي هذا التفاعل لمدة 30 ثانية في 10،000 مرة G في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان وإزالة supernatant.
ثم أضف 15 ميكرولتر من وسط التركيب مع أو بدون DAPI. ماصة 10 ميكرولتر من هذه الديدان الملطخة على شريحة المجهر ووضع زلة غطاء فوق القمة. لتحليل الديدان الملطخة ب DY96 المثبتة على الشرائح، قم بإجراء التصوير باستخدام قناة GFP لمجهر التألق.
لتحديد مدى لياقة مجموعات الديدان ، استخدم هدفا 5X أو 10X لفحص جاذبية أكثر من 100 دودة لكل حالة. في 72 ساعة بعد الإصابة ، تم إصلاح F1 وتلوينها ب DY96 لتقييم مقاومة microsporidia. تم تحديد السكان الأبوين المصابين والضوابط غير المصابة في 72 ساعة بعد الإصابة وملطخة ب DY96 لتصور أجنة الدودة وجراثيم microsporidia.
الحيوانات المصابة صغيرة ، وتحتوي على العديد من جراثيم microsporidia ، وتنتج أجنة أقل من الضوابط الصحية غير المصابة. أظهر تقييم جاذبية الديدان أن ما يقرب من 95٪ من الحيوانات غير المصابة أنتجت ذرية ، مقارنة بالحيوانات المصابة ، التي كانت أقل من 80٪ كشفت الكميات أن ما يقرب من 90٪ من السكان المعالجين بالميكروسبوريديا أصيبوا بالعدوى ، كما هو محدد بعدد الديدان التي تحتوي على جراثيم ملطخة ب DY96. كشفت القياسات الكمية لهذه الحيوانات الثابتة أن الديدان الجاهزة تحتوي على أجنة أكثر بكثير من نظيراتها الساذجة ، مما يشير إلى لياقة أكبر في مواجهة العدوى.
تم استخدام فيجي ImageJ لتحديد العبء الطفيلي للديدان الفردية الساذجة والمناعية ، وهي النسبة المئوية للجسم المملوء بجراثيم N.parisii الفلورية. كشفت القياسات الكمية عن انخفاض كبير في عبء طفيليات الديدان التي جاءت من الآباء المصابين. علاوة على ذلك ، كشفت حسابات حجم الدودة الفردية أن الديدان الجاهزة لها ميزة نمو كبيرة على الحيوانات الساذجة في مواجهة عدوى N.parisii.
كشفت دراسات التصوير أنه في حين أن الحيوانات الساذجة تحتوي عادة على جراثيم متعددة والعديد من الخلايا المصابة ، فإن الحيوانات الجاهزة لديها جراثيم أقل بكثير أو معدومة وعادة لا تحتوي على جراثيم بوغية. إذا كان لدى مجموعات F1 غير المهيأة والجاهزة أعدادا متشابهة من الحيوانات المصابة والمصابة ، فقم بحساب عدد البيض لكل ، وقم بتحليل الأنسجة المصابة باستخدام ImageJ للعثور على اختلافات أكثر دقة. في حين أن البقع الصفراء المباشرة 96 تنضج الجراثيم ، فإن التهجين الفلوري في الموقع يمكن أن يكشف عن البلازما الجراثيمية داخل الخلايا.
هذا يمكن أن يظهر لك عدد الخلايا المصابة في الديدان الجاهزة وغير المهيأة. وقد أظهرت هذه التقنيات أن استجابة النسخ الأبوية يمكن أن تكون مفيدة في تحفيز المناعة الموروثة في النسل. ويحقق الباحثون الآن في طبيعة هذه المناعة لدى النسل.
