Estamos estudiando cómo reaccionan las coles a la falta de oxígeno a nivel molecular. Dado que las coles son difíciles de obtener, estamos desarrollando un sistema utilizando células de repollo aisladas. Al exponer estas células de repuesto, también conocidas como protoplastos, a condiciones de bajo oxígeno, podemos investigar fácilmente su respuesta al estrés.
Trabajar con protoplasto suspendido en solución para estudiar las respuestas a niveles bajos de oxígeno es complicado. El gran desafío es mantener suficiente oxígeno para nuestras muestras de control. Descubrimos una manera de bombear el oxígeno del líquido.
Hemos validado el método a través de ensayos reporteros de marcadores de hipoxia. Revisamos diferentes métodos para manejar el bajo nivel de oxígeno y descubrimos que el paquete de absorción de oxígeno funciona mejor. Es fácil de usar y eficaz, por lo que es ideal para estudiar cómo se comportan los protoplastos en condiciones de bajo oxígeno.
El estudio del mecanismo molecular en cultivos de hoja en condiciones de hipoxia ha sido un desafío debido a la limitación de las herramientas disponibles, pero con los avances recientes, hemos logrado un gran progreso mediante el uso de un sistema de protoplasto de repollo con tratamiento de hipoxia. Este nuevo método nos está ayudando a comprender cómo el bajo nivel de oxígeno afecta a estas plantas a nivel molecular. En el futuro, planeamos combinar el sistema de protoplast con inmunoprecipitación y ensayos reporteros para ilustrar la vía de regulación molecular involucrada en el repollo durante el estrés por inundación.
Nuestro objetivo es identificar los reguladores clave de la tolerancia a las inundaciones, que esperamos ayudar a mejorar la mejora de un nuevo cultivar de repollo con una mejor tolerancia a las inundaciones. Para comenzar, llene los agujeros redondos de forma cuadrada de una bandeja de tapones de 48 pocillos con sustrato de plantas comerciales y siembre Fuyudori y 228 semillas de repollo aproximadamente a un centímetro de profundidad en el medio de cultivo. Para preparar 12,5 mililitros de solución enzimática, precaliente una solución que contenga 10 milimolares MES y 0,6 molares de manitol a 55 grados centígrados.
A continuación, añadir 1,5% de celulasa R-10 y 0,75% de macerozima R-10. Revuelva la solución y continúe calentando a 55 grados centígrados durante 10 minutos. Deje que la solución enzimática se enfríe a temperatura ambiente.
A continuación, añadir 10 milimolares de cloruro cálcico y 0,1% de albúmina sérica bovina. Con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros, esterilice la solución enzimática en una placa de Petri de nueve centímetros. Después de dos o tres semanas de crecimiento, recoja las plántulas de repollo en la segunda etapa de la hoja para el aislamiento del protoplasto mesófilo.
Recoja las segundas hojas verdaderas recién expandidas de cinco a ocho plántulas de repollo. Con una cuchilla de afeitar afilada, corte las hojas en tiras de 0,5 a 1,0 milímetros. Transfiera inmediatamente las tiras de hojas a la solución enzimática recién preparada.
Someta las tiras de hojas de repollo a la infiltración al vacío en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la infiltración al vacío, mantenga las tiras de hojas sumergidas en la solución enzimática en la oscuridad durante cuatro a 16 horas. Al día siguiente, diluir la solución que contiene protoplastos con un volumen igual de solución W5 para detener la digestión enzimática.
Para liberar la suspensión de los protoplastos, agite suavemente la mezcla en un agitador orbital. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar la solución de protoplasto a 150 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Agregue 10 mililitros de solución W5 a lo largo de la pared del tubo a un caudal de aproximadamente un mililitro por segundo para lavar los protoplastos granulados. Después de la última centrifugación, vuelva a suspender los protoplastos en la solución W5 y coloque el tubo en hielo durante 30 minutos. A continuación, retire un mililitro de sobrenadante a la vez hasta que se elimine todo el sobrenadante.
Vuelva a suspender los protoplastos en una solución de MMG preenfriada con hielo. Mida la concentración de protoplasto con un hemocitómetro. Ajuste la concentración final a 4 veces 10 a la potencia de 5 protoplastos por mililitro usando solución de MMG.
Después del aislamiento y la digestión durante la noche, el rendimiento de protoplastos fue de 1,04 por 10 elevado a 7 para Fuyudori y de 4,00 por 10 a potencia de 6 protoplastos por gramo de peso fresco para 228. La eficiencia de la transfección de protoplastos fue superior al 40% tanto en Fuyudori como en 228 cultivares, como lo demuestra el gen reportero GFP. Después de aislar el protoplasto de repollo, mezcle 100 microlitros de 4 por 10 a la potencia de 4 protoplastos con 10 microlitros de plásmido y coloque la mezcla en hielo durante 10 minutos.
Agregue un volumen igual de solución de PEG recién preparada a la solución de protoplast y mezcle suavemente. Incubar la mezcla de protoplast a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. Luego agregue 440 microlitros de solución W5 para terminar la reacción.
Centrifugar los protoplastos transfectados a 150 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet en 750 microlitros de solución W5 enriquecida con oxígeno. Transfiera los protoplastos resuspendidos a una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos precodificada con albúmina sérica bovina al 1%.
Para la hipoxia inducida por la bolsa que consume oxígeno, coloque una placa que contenga la solución de protoplasto W5 en un frasco anaeróbico de 3,5 litros. Luego agregue dos paquetes de absorción de oxígeno en el frasco para crear un ambiente hipóxico. Después del tratamiento, centrifugar los protoplastos a 150 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y congele los protoplastos recolectados en nitrógeno líquido antes de proceder al ensayo de luciferasa dual. El paquete absorbente de oxígeno indujo un aumento de 7,0 veces en la actividad del promotor de BoADH1 en comparación con el control, demostrando la respuesta hipóxica más alta. La actividad del promotor de BoSUS1L aumentó más de 5,6 veces, y el tratamiento con paquete absorbente de oxígeno mostró la mayor inducción entre los tratamientos.
