Mesure induite glutathion-réponse d'alimentation à Hydra

Résumé

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Résumé

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Introduction

Hydra is the most primitive organism possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey¹. It feeds on a variety of animals such as nematode, crustacea, insect larvae, tadpoles and newly hatched fish¹. The movement of these prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging capsules called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey². GSH present in the fluid released from the injured prey subsequently activates the feeding response in hydra which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth, and consequent engulfing of the prey. Multiple molecules, such as dopamine³, glutamate⁴, GABA, glycine⁵, NMDA receptors⁶, and allatotropin⁷, have been shown to be involved in the feeding response in hydra. It has also been shown that the chemosensory response induced by GSH is modulated by the feeding status of the animal such that starved hydra exhibited enhanced feeding response¹. Such an increase in the GSH sensitivity is biologically relevant since under starvation hydra need to find its prey at higher sensitivity.

Although the feeding response induced by GSH can be clearly observed under microscope, the methods typically used for measuring the feeding response observations are non-quantitative. In most of the cases, the time during which the mouth of the hydra remains open was taken as a measure of the feeding response^8,9; whereas in another case, quantitation was based on the number of hydra out of a population showing the feeding response¹⁰. However, observing the mouth opening time of the hydra polyps is cumbersome and subject to variation induced by uncontrollable parameters such as the direction of the mouth orientation during observations. Similarly, since the feeding response is a quantitative parameter, population-based approaches are subject to variations/errors caused by the opinion or observational bias of the individual observer. To circumvent these issues we have developed a method for the relative quantification of the feeding response in hydra (Hydra vulgaris Ind-Pune¹¹) based on the distance of the apical end of the tentacle from the mouth of the hydra polyp.

Protocole

1. Hydra culture et la mesure de la réponse d'alimentation

1. Maintenir polypes hydra en culture en les alimentant tous les jours avec des artémias et les conserver dans un moyen (1 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de NaCl, 1 mM de _CaCl2, 0,1 mM de KCl, 0,1 mM et MgSO ₄₎ contenu dans un bol verre à 18 ° C sous la lumière 12 h 12 cycles sombres de h comme décrit plus haut ^12.
2. Pour mesurer la réponse d'alimentation, de transfert d'âge mûr polype hydre ayant 5 à 6 tentacules à un seul puits d'une plaque de 24 puits. Retirez le moyen résiduel du bien en l'inclinant, puis ajouter immédiatement 500 pi de milieu frais.
3. Préparer la solution de glutathion 9 uM dans le milieu hydre. Etant donné que la solution de glutathion est sujette à l'oxydation, en utilisant toujours une solution fraîchement préparée de glutathion pour chaque expérience.
4. Transférer la plaque de la plate-forme de formation d'image d'un microscope comportant des dispositifs pour l'enregistrement de l'image. Utilisez un fond sombre telle que le comportement opolype hydre f peut être clairement illustré dans le contexte contrasté.
5. La salle utilisée pour l'observation et l'imagerie du comportement de Hydra gratuit de feux dont l'intensité, la fluctuation des courants d'air et le bruit. De telles perturbations peuvent également causer le polype hydre à afficher contraction des tentacules - même en l'absence de glutathion.
6. Laisser le polype pour se détendre pendant 5 min.
7. Assurez-vous que le polype est situé le long de la région centrale du bien telle que le comportement peut être imagée clairement. Si le polype est au bord du puits, apporter au centre par le moyen de rinçage à l'aide d'une pipette de nouveau et lui permettre de se relaxer.
8. Capturer une image de l'hydre à l'état détendu. Ce sera l'observation du point zéro-temps.
9. Ajouter rapidement 9 uM solution de glutathion pour atteindre une concentration finale de 3 uM dans le puits. Selon le but de l'expérience et de la réponse montre hydre, tester une gamme de différentes concentrations de glutathion et chooSE concentration appropriée requise.
10. Lancer le chronomètre immédiatement après addition d'une solution de glutathion et de capturer des images après chaque 15-30 sec pour 4-5 min. Ne pas modifier les paramètres d'agrandissement au cours de l'imagerie time-lapse.
11. Ajouter la solution de glutathion doucement et avec un débit uniforme de telle sorte que la position de l'animal dans le puits serait très peu perturbé dans le champ de vision du microscope. Toutefois, si le polype se déplace largement après addition d'une solution de glutathion, déplacer la plaque très doucement pour amener le polype dans le champ de vision pour la capture d'image.
12. Dans l'expérience de contrôle, utilisez défaut moyen glutathion tout en gardant tous les autres paramètres identiques.
13. Assurez-vous d'effectuer toutes les étapes expérimentales ci-dessus au cours de la première moitié de la journée - avant 13 heures pour éviter l'effet possible du rythme circadien sur la mesure de la réponse de l'alimentation.
14. Ouvrez chacune des images capturées à l'aide de l'Image Manipulation Program GIMP (GNU).
15. Utilisez la fonction "Mesure" disponible à partir de Menu> Outils> Mesurer pour déterminer la distance entre l'extrémité apicale de chacun des tentacules et hypostome. Si l'ouverture de la bouche est observée dans aucune des images, déterminer la distance entre le centre de la bouche ouverte et l'extrémité apicale du tentacule. Reportez-vous à cette distance que la propagation de tentacule.
16. Calculer la propagation de tentacule moyenne pour chaque polype avant et après exposition de glutathion. Calculer le rapport de la propagation de tentacule moyenne au point zéro de temps pour que à chacun des points de temps ultérieurs. Ce rapport sera appelé rapport tentacule propagation.
17. Répétez mesures pour au moins 20 polypes.

2. Validation de la méthode utilisant leLa famine modèle

1. Pour la famine, transférer quelques polypes hydra dans un bol en verre séparée et ne les nourrissez pas pendant 5 jours. Nourrir le groupe de quelques polypes de contrôle quotidien avec artémias dans un bol de taille similaire. Changer le support à la fois expérimentale bols par jour pour éviter le développement de champignons dans le milieu.
2. Le jour de l'expérience, nourrir le groupe de l'hydre de commande avec artémias pendant 1 heure et utiliser ces hydre pour les expériences ultérieures après avoir retiré artémias non consommés et mort du milieu.
3. Mesurer la réponse d'alimentation de l'hydre de faim par rapport à l'hydre de groupe de contrôle par la méthode décrite précédemment à l'étape 1. Pour éviter tout biais dû au temps de l'observation, alterner les mesures de chacun des affamés et contrôler polypes Hydra.

Résultats

Le glutathion provoque hydre exposer curling des tentacules vers la bouche dans le but d'engloutir la proie. Cette curling de tentacules apporte extrémités apicales des tentacules plus près de la hypostome. Cela se traduit par la réduction de la propagation du tentacule, ou la distance linéaire entre l'extrémité apicale du tentacule et hypostome (figure 1). La propagation de tentacule relative, ou le rapport de tentacule moyenne réparties avant et après l'ajout de glutathion, en moy...

Discussion

Comportement alimentaire dans hydre représente l'un des systèmes les plus chimiosensoriels ancestrales dans les métazoaires. Bien que la présence de GSH dans le liquide crustacé libéré après la capture des proies assisté nématocyste-été détecté depuis longtemps ^1, ni la protéine GSHR ni le gène codant putatif / s ont été caractérisés à ce jour de Hydra. Quelques tentatives ont été effectuées pour caractériser GSH protéines de liaison à hydre ^{8, 14, 15.} Cependant, l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cooled Incubator	Panasonic	MIR-254-PE
Microscope	Leica	S8AP0
Camera for the microscope	Leica	EC3
Reduced glutathione	Sigma	G4251	Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program	GIMP	Version 2.8