Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Les expectorations synthétiques de la fibrose kystique (SCFM2) peuvent être utilisées en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et le tri cellulaire activé par fluorescence pour observer les agrégats bactériens à haute résolution. Cet article détaille les méthodes permettant d’évaluer les populations agrégées pendant le traitement antimicrobien en tant que plate-forme pour de futures études.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est l’un des agents pathogènes opportunistes les plus courants associés à la fibrose kystique (FK). Une fois la colonisation pa établie, une grande partie des bactéries infectieuses forment des biofilms dans les expectorations des voies respiratoires. Il a été démontré que les biofilms de Pa isolés des expectorations de la FK se développent en petits agrégats denses d’environ 10 à 1 000 cellules qui sont organisés spatialement et présentent des phénotypes cliniquement pertinents tels que la tolérance aux antimicrobiens. L’un des plus grands défis de l’étude de la façon dont les agrégats de Pa réagissent à l’environnement changeant des expectorations est le manque de systèmes pertinents et robustes sur le plan nutritionnel qui favorisent la formation d’agrégats. À l’aide d’un milieu synthétique d’expectorations CF (SCFM2), l’histoire de vie des agrégats de Pa peut être observée à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et de l’analyse d’images à la résolution d’une seule cellule. Ce système in vitro permet l’observation de milliers d’agrégats de taille variable en temps réel, en trois dimensions et à l’échelle du micron. Au niveau individuel et au niveau de la population, la capacité de regrouper les agrégats par phénotype et par position facilite l’observation des agrégats à différents stades de développement et leur réponse aux changements dans le microenvironnement, tels que le traitement antibiotique, à différencier avec précision.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un agent pathogène opportuniste qui établit des infections chroniques chez les personnes immunodéprimées. Pour les personnes atteintes de la maladie génétique de la fibrose kystique (FK), ces infections peuvent s’étendre sur toute une vie. La mucoviscidose provoque l’accumulation d’expectorations visqueuses et riches en nutriments dans les voies respiratoires, qui deviennent colonisées par une variété d’agents pathogènes microbiens au fil du temps. Le Pa est l’un des agents pathogènes les plus répandus de la FK, colonisant les voies respiratoires dans la petite enfance et établissant des infections difficiles à traiter....

Protocole

1. Préparer un milieu synthétique de fibrose kystique (SCFM2)

NOTE: La préparation de SCFM2 comprend trois étapes principales décrites ci-dessous (Figure 2). Pour plus de détails et de références, voir^9,10,12.

Figure 2: Préparation et inoculation du milieu SCFM2. (A) La base ....

Résultats

Ce travail détaille les méthodes permettant d’observer les agrégats de Pa à haute résolution et dans un environnement similaire à celui de l’infection chronique du poumon CF^9,10,12. SCFM2 fournit un système in vitro qui favorise l’agrégation naturelle des cellules Pa dans des tailles similaires à celles observées lors de l’infection réelle¹⁰. L’adaptabilité.......

Discussion

Ce travail a introduit des méthodologies qui peuvent être combinées pour étudier les populations bactériennes agrégées en présence et en l’absence de traitement antibiotique. Le CLSM haute résolution permet de visualiser les changements dans la biomasse agrégée et l’orientation structurelle des agrégats en temps réel lorsqu’ils sont exposés à des antibiotiques. En outre, les caractéristiques physiques et structurelles de la biomasse qui restent après le traitement avec des antibiotiques peuvent êt.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino acids
Alanine	Acrs Organics	56-41-7
Arginine HCl	MP	1119-34-2
Asparagine	Acrs Organics	56-84-8	Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl	Alfa Aesar	L06328
Glutamic acid HCl	Acrs Organics	138-15-8
Glycine	Acrs Organics	56-40-6
Histidine HCl H2O	Alfa Aesar	A17627
Isoleucine	Acrs Organics	73-32-5
Leucine	Alfa Aesar	A12311
Lysine HCl	Alfa Aesar	J62099
Methionine	Acrs Organics	63-68-3
Ornithine HCl	Alfa Aesar	A12111
Phenylalanine	Acrs Organics	63-91-2
Proline	Alfa Aesar	A10199
Serine	Alfa Aesar	A11179
Threonine	Acrs Organics	72-19-5
Tryptophan	Acrs Organics	73-22-3	Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine	Alfa Aesar	A11141	Prepared in 1.0 M NaOH
Valine	Acrs Organics	72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin	Alfa Aesar	J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O	Fisher Chemical	C79-500
Dextrose (D-glucose)	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher (Avanti Polar Lipids)	4235-95-4	shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O	Acrs Organics	7782-63-0	this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid	Alfa Aesar	L13242	pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acrs Organics	7791-18-6
N-acetylglucosamine	TCI	A0092
Prepared solids
Porcine mucin	Sigma	M1778-100G	UV-sterilize
Salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011
Stain
Propidium iodide	Alfa Aesar	J66764MC
Salts
K2SO4	Alfa Aesar	A13975
KCl	Alfa Aesar	J64189	add solid directly to buffered base
KNO3	Acrs Organics	7757-79-1
MOPS	Alfa Aesar	A12914	add solid directly to buffered base
NaCl	Fisher Chemical	S271-500	add solid directly to buffered base
Na2HPO4	RPI	S23100-500.0
NaH2PO4	RPI	S23120-500.0
NH4Cl	Acrs Organics	12125-02-9	add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL)	Olympus plastics	28-101
Conical tubes (50 mL)	Olympus plastics	28-106
Culture tubes w/air flow cap	Olympus plastics	21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish	CellVis	NC0600518
Luria Bertani (LB) broth	Genessee Scientific	11-118
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Bioreagents	BP2944100
Pipet tips (p200)	Olympus plastics	23-150RL
Pipet tips (p1000)	Olympus plastics	23-165RL
Serological pipets (5 mL)	Olympus plastics	12-102
Serological pipets (25 mL)	Olympus plastics	12-106
Serological pipets (50 mL)	Olympus plastics	12-107
Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water	Genessee Scientific	18-194	Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL)	BD	794412
Syringes (50 mL)	BD	309653
0.22 mm PES syringe filter	Olympus plastics	25-244
PS cuvette semi-mico	Olympus plastics	91-408
Software
Biorender			To prepare the figures
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris	Bitplane		version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu	Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope	Zeiss