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Erratum Notice

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Résumé

Ces protocoles aideront les utilisateurs à sonder le métabolisme énergétique mitochondrial dans les sphéroïdes dérivés de lignées cellulaires cancéreuses 3D à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire Seahorse.

Résumé

Les agrégats cellulaires tridimensionnels (3D), appelés sphéroïdes, sont devenus l’avant-garde de la culture cellulaire in vitro ces dernières années. Contrairement à la culture de cellules en tant que monocouches unicellulaires bidimensionnelles (culture 2D), la culture de cellules sphéroïdes favorise, régule et soutient l’architecture cellulaire physiologique et les caractéristiques qui existent in vivo, y compris l’expression des protéines de matrice extracellulaire, la signalisation cellulaire, l’expression génique, la production de protéines, la différenciation et la prolifération. L’importance de la culture 3D a été reconnue dans de nombreux domaines de recherche, notamment l’oncologie, le diabète, la biologie des cellules souches et le génie tissulaire. Au cours de la dernière décennie, des méthodes améliorées ont été développées pour produire des sphéroïdes et évaluer leur fonction métabolique et leur devenir.

Les analyseurs de flux extracellulaire (XF) ont été utilisés pour explorer la fonction mitochondriale dans des microtissus 3D tels que les sphéroïdes à l’aide d’une plaque de capture d’îlot XF24 ou d’une microplaque sphéroïde XFe96. Cependant, des protocoles distincts et l’optimisation du métabolisme énergétique mitochondrial sondant chez les sphéroïdes à l’aide de la technologie XF n’ont pas été décrits en détail. Cet article fournit des protocoles détaillés pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial dans des sphéroïdes 3D uniques à l’aide de microplaques sphéroïdes avec l’analyseur XFe96 XF. En utilisant différentes lignées cellulaires cancéreuses, il est démontré que la technologie XF est capable de distinguer la respiration cellulaire dans les sphéroïdes 3D de différentes tailles, mais aussi de différents volumes, numéros de cellules, contenu et type d’ADN.

Les concentrations optimales de composé effecteur mitochondrial d’oligomycine, de BAM15, de roténone et d’antimycine A sont utilisées pour sonder des paramètres spécifiques du métabolisme énergétique mitochondrial dans les sphéroïdes 3D. Cet article traite également des méthodes permettant de normaliser les données obtenues à partir de sphéroïdes et aborde de nombreuses considérations qui devraient être prises en compte lors de l’exploration du métabolisme des sphéroïdes à l’aide de la technologie XF. Ce protocole aidera à stimuler la recherche sur des modèles avancés de sphéroïdes in vitro .

Introduction

Les progrès des modèles in vitro dans la recherche biologique ont progressé rapidement au cours des 20 dernières années. Ces modèles incluent désormais des modalités d’organe sur puce, des organoïdes et des sphéroïdes de microtissus 3D, qui sont tous devenus un objectif commun pour améliorer la traduction entre les études in vitro et in vivo. L’utilisation de modèles in vitro avancés, en particulier les sphéroïdes, couvre plusieurs domaines de recherche, notamment l’ingénierie tissulaire, la recherche sur les cellules souches, le cancer et la biologie des maladies 1,2,3,4,5,6,7, et les tests de sécurité, y compris la toxicologie génétique 8,9,10, la toxicologie des nanomatériaux 11, 12,13,14, et tests d’innocuité et d’efficacité des médicaments 8,15,16,17,18,19.

La morphologie cellulaire normale est essentielle au phénotype et à l’activité biologiques. Cultiver des cellules en sphéroïdes de microtissus 3D permet aux cellules d’adopter une morphologie, une fonction phénotypique et une architecture, plus proches de celles observées in vivo mais difficiles à capturer avec les techniques classiques de culture cellulaire monocouche. Tant in vivo qu’in vitro, la fonction cellulaire est directement affectée par le microenvironnement cellulaire, qui ne se limite pas à la communication et à la programmation cellulaires (p. ex., formations de jonctions cellule-cellule, possibilités de former des niches cellulaires); l’exposition cellulaire aux hormones et aux facteurs de croissance dans les environnements immédiats (p. ex., exposition aux cytokines cellulaires dans le cadre d’une réponse inflammatoire); la composition des matrices physiques et chimiques (p. ex., si les cellules sont cultivées dans un plastique de culture tissulaire rigide ou dans un environnement tissulaire élastique); et surtout, comment le métabolisme cellulaire est affecté par la nutrition et l’accès à l’oxygène ainsi que par le traitement des déchets métaboliques tels que l’acide lactique.

L’analyse du flux métabolique est un moyen puissant d’examiner le métabolisme cellulaire dans des systèmes in vitro définis. Plus précisément, la technologie XF permet d’analyser les changements en direct et en temps réel dans la bioénergétique cellulaire des cellules et des tissus intacts. Étant donné que de nombreux événements métaboliques intracellulaires se produisent dans l’ordre de quelques secondes à quelques minutes, les approches fonctionnelles en temps réel sont primordiales pour comprendre les changements en temps réel du flux métabolique cellulaire dans les cellules et les tissus intacts in vitro.

Cet article fournit des protocoles pour la culture des lignées cellulaires dérivées du cancer A549 (adénocarcinome pulmonaire), HepG2/C3A (carcinome hépatocellulaire), MCF-7 (adénocarcinome du sein) et SK-OV-3 (adénocarcinome ovarien) en tant que modèles sphéroïdes 3D in vitro utilisant des approches d’agrégation forcée (Figure 1). Il décrit également en détail comment sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide de l’analyseur Agilent XFe96 XF, (ii) met en évidence les moyens d’optimiser les tests XF à l’aide de sphéroïdes 3D uniques, et (iii) discute des considérations et des limites importantes de la sonde du métabolisme des sphéroïdes 3D à l’aide de cette approche. Plus important encore, cet article décrit comment sont collectés des ensembles de données qui permettent le calcul du taux de consommation d’oxygène (OCR) pour déterminer la phosphorylation oxydative et donc la fonction mitochondriale dans les sphéroïdes cellulaires. Bien qu’il ne soit pas analysé pour ce protocole, le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est un autre paramètre mesuré aux côtés des données OCR dans les expériences XF. Cependant, ECAR est souvent mal ou mal interprété à partir des jeux de données XF. Nous fournissons un commentaire sur les limites du calcul de l’ECAR en suivant les approches de base du fabricant de la technologie.

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Protocole

figure-protocol-68
Figure 1 : Flux de travail graphique pour la génération de sphéroïdes cellulaires, l’analyse du flux extracellulaire et les essais en aval. Quatre lignées cellulaires cancéreuses ont été cultivées sélectivement sous forme de monocouches (A), détachées de flacons de culture tissulaire et ensemencées dans des microplaques ultrabasses de 96 puits pour former des sphéroïdes (B). Le carcinome pulmonaire A549, le carcinome hépatique HepG2/C3A, l’adénocarcinome ovarien SK-OV-3 et le carcinome du sein MCF-7 ont été ensemencés à 1 × 103-8 × 103 cellules/ puits et ont grandi jusqu’à 7 jours pour former des sphéroïdes uniques et optimiser la densité d’ensemencement des sphéroïdes et le temps de culture par observation continue et mesures planimétriques. Une fois formés, les sphéroïdes simples ont été lavés dans un milieu XF sans sérum et soigneusement ensemencés dans des microplaques de dosage sphéroïde, pré-enduites de poly-D-lysine (C). Les sphéroïdes ont été soumis à une analyse du flux extracellulaire à l’aide de l’analyseur XFe96 utilisant plusieurs protocoles pour traiter: (1) la taille optimale des sphéroïdes pour la réponse respiratoire mitochondriale basale; (2) titrage optimisé des inhibiteurs respiratoires mitochondriaux; (3) optimisation du placement des sphéroïdes dans les puits de microplaques. (D) Les analyses post-XF, la microscopie à contraste de phase et la quantification de l’ADN sphéroïde ont été utilisées pour la normalisation des données et d’autres essais in vitro en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Culture de lignées cellulaires cancéreuses sous forme de sphéroïdes in vitro 3D

Lignée cellulaireDescriptionMilieu de cultureSource
L’A549Lignée cellulaire de carcinome pulmonaireRPMI 1640Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées (ECACC)
Pyruvate de sodium (1 mM)
Pénicilline- Streptomycine - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
HepG2/C3ALignée cellulaire de carcinome hépatique, un dérivé clonal de la lignée cellulaire parente HepG2LeCollection américaine de culture tissulaire (ATCC)
Pénicilline- Streptomycine - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
MCF7Lignée cellulaire d’adénocarcinome du seinRPMI 1640Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées (ECACC)
Pyruvate de sodium (1 mM)
Pénicilline- Streptomycine - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
SK-OV-3Lignée cellulaire de l’adénocarcinome ovarienRPMI 1640Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées (ECACC)
Pyruvate de sodium (1 mM)
Pénicilline- Streptomycine - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
ComposantMilieu d’essai RPMI (volume final de 50 mL)
Milieu de baseAgilent Seahorse XF RPMI, pH 7,4
Glucose (1 M de stock stérile)11 mM (solution mère de 0,55 mL)
L-glutamine (stock stérile de 200 mM)2 mM (0,5 mL de solution mère)
Pyruvate de sodium (stock stérile de 100 mM)1 mM (0,5 mL de solution mère)

Tableau 1 : Compositions des milieux de lignées cellulaires cancéreuses et des milieux XF.

  1. Cultivez toutes les lignées cellulaires à l’aide de la technique de culture tissulaire aseptique standard et confirmez qu’elles sont exemptes de mycoplasmes à l’aide d’un kit de dosage approprié.
  2. Cultiver les lignées cellulaires dans des flacons de culture tissulaire T75 ou l’équivalent, en utilisant le milieu recommandé (tableau 1). Cultivez les lignées cellulaires à 65-80% de confluence et passez-les régulièrement jusqu’à un maximum de 25 passages.
  3. Rincez les flacons de culture cellulaire deux fois dans la solution saline tamponnée au phosphate (DBPS) modifiée de Dulbecco.
  4. Détacher les cellules des flacons avec 3 mL de réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min à 37 °C et confirmer le détachement par microscopie.
  5. Aspirer doucement la suspension cellulaire détachée pour assurer une suspension unicellulaire et désactiver le réactif de dissociation cellulaire avec 7 mL de milieu de culture tissulaire complet.
  6. Prélever les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu complet.
  7. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé et titrez à la densité cellulaire souhaitée requise pour l’ensemencement.
    REMARQUE: Pour ensemencer une plaque entière de 96 puits à 100 μL / puits à 4 × 103 cellules / puits, les cellules doivent être titrées à 4 × 104 cellules / mL dans un volume recommandé de 12 mL.
  8. Décanter la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et distribuer 100 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une microplaque répulsive cellulaire à l’aide d’un pipettor multicanal.
    REMARQUE: Seuls les 60 puits intérieurs d’une microplaque doivent être ensemencés et le reste rempli de DPBS. Cela formera une barrière d’évaporation, assurera l’homogénéité des sphéroïdes sur la plaque et minimisera les effets de bord de la plaque.
  9. Centrifuger les microplaques sphéroïdes à 300 × g pendant 15 min pour forcer les cellules en agrégats lâches.
  10. Incuber les plaques à 37 °C, 5% de CO2 pendant au moins 3 jours pour assurer la formation de sphéroïdes.
  11. Effectuer une microscopie à contraste de phase en utilisant des pratiques de laboratoire normalisées pour surveiller la croissance des sphéroïdes. Reconstituer le milieu de culture cellulaire tous les 3 jours ou deux fois par semaine en effectuant un échange de milieu d’un demi-volume.

2. Sonder le métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes simples à l’aide de la technologie de flux extracellulaire (XF)

  1. Préparation du test (un jour avant)
    1. Vérifiez la viabilité des sphéroïdes à l’aide d’un microscope à lumière inversée avec contraste de phase à un grossissement de 4x pour assurer une structure sphéroïde intacte, une morphologie et une uniformité globale entre les échantillons.
    2. Hydratez la cartouche du capteur.
      1. Aliquote ~20 mL du calibrant dans un tube conique.
      2. Placer le tube conique contenant l’étrier dans un incubateur sans CO2 37 °C pendant la nuit.
      3. Retirez le contenu du kit d’analyse.
      4. Retirez la cartouche du capteur de la plaque utilitaire et placez-la à l’envers sur le plan de travail à côté de la plaque utilitaire.
      5. Pipette 200 μL de ddH2O stérile dans chaque puits de la plaque d’utilité de la cartouche du capteur à l’aide d’une pipette P300 multicanal.
      6. Placez la cartouche du capteur sur le dessus de la plaque utilitaire.
      7. Vérifiez que le niveau d’eau dans chaque puits est suffisamment élevé pour submerger les sondes du capteur.
      8. Transférez la cartouche de capteur assemblée dans un incubateur sans CO2 37 °C et laissez-la toute la nuit.
        REMARQUE: Cette étape peut être effectuée 12 à 72 heures avant le début du test.
  2. Microplaque de dosage sphéroïde de couche
    1. À l’aide de techniques aseptiques, ajouter 30 μL/puits de poly-D-lysine stérile (0,1 mg/mL) à la microplaque sphéroïde et l’incuber pendant 30 min à température ambiante.
    2. Aspirer la solution de chaque puits de la microplaque sphéroïde, inverser la plaque et la tapoter fermement sur le papier de soie pour éliminer toute solution résiduelle.
    3. Laver la plaque deux fois avec 200 μL/puits de ddH2O stérile.
    4. Après le lavage final, inverser la microplaque et la tapoter fermement sur du papier de soie pour éliminer toute eau résiduelle.
    5. Laisser sécher la plaque à l’air libre pendant 30 min avant de l’utiliser ou de la stocker à 4 °C pour une utilisation future.
      REMARQUE: La microplaque de dosage des sphéroïdes doit être recouverte d’un adhésif moléculaire pour s’assurer que les sphéroïdes sont fixés au bas de la microplaque. Sans adhésif moléculaire, les sphéroïdes peuvent se déloger et interférer avec les résultats des tests. D’autres adhésifs moléculaires peuvent également être utilisés comme alternative à la poly-D-lysine pour les plaques de prérevêtement. Les plaques prélaquées peuvent être conservées à 4 °C, mais doivent être laissées à la température ambiante avant le début du dosage.
  3. Préparer le milieu du test XF
    1. Préparer le milieu XF RPMI, comme indiqué dans le tableau 1, et le filtre stérile avec un filtre à seringue de 0,22 μm
  4. Préparation du test (1 h avant le test)
    1. Préchauffer le milieu d’essai XF RPMI supplémenté jusqu’à 37 °C.
    2. Préchauffer la microplaque de dosage sphéroïde revêtue dans un incubateur ou un bain sec sans CO2 à 37 °C.
    3. Préparez la cartouche du capteur.
      1. Retirez le tube conique contenant l’étrier et la cartouche du capteur de l’incubateur à air.
      2. Retirez la cartouche du capteur de la plaque utilitaire et placez-la à l’envers sur la surface de travail.
      3. À l’aide d’une pipette multicanal P300, aspirez l’eau de la plaque de service public et jetez-la.
      4. Versez la solution d’étriquant dans un réservoir de réactif stérile et ajoutez 200 μL/puits du calibrant préavertissé à la plaque utilitaire à l’aide d’une pipette multicanal P300.
      5. Prenez la cartouche du capteur et replacez-la sur la plaque d’utilité, en vous assurant que les capteurs sont bien immergés dans l’étrier.
      6. Transférer la cartouche de capteur assemblée dans l’incubateur sans CO2 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à charger les solutions d’injection de orifice.
  5. Lavez les sphéroïdes avec le milieu d’essai.
    1. Retirez la plaque de culture sphéroïde de l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et observez les sphéroïdes au microscope pour assurer leur intégrité avant les étapes de transfert des sphéroïdes.
    2. Charger tous les puits de la plaque sphéroïde avec 180 μL/puits de milieu d’essai préavertis, y compris tous les puits de correction de fond.
    3. Remplissez partiellement une boîte de Petri de 7 cm avec 3 mL du milieu d’essai.
    4. À l’aide d’une pipette multicanal chargée de larges pointes de pipette à orifice, transférez les sphéroïdes de la plaque de culture à 96 puits dans des boîtes de Petri de 7 cm en réglant le pipetteur à un volume d’aspiration de 10 à 50 μL.
  6. Ensemencez les sphéroïdes dans la microplaque de dosage des sphéroïdes pré-enduits.
    1. À l’aide d’un microscope à dissection et d’un appareil lightbox, transférez les sphéroïdes de la boîte de Petri à la microplaque de dosage des sphéroïdes, comme indiqué ci-dessous.
      1. Réglez le volume d’un pipetteur monocanal équipé d’une large pointe de pipette à orifice à 20 μL et aspirez soigneusement un seul sphéroïde. Placez la pointe directement au centre de chaque puits de la microplaque d’essai sphéroïde et laissez la gravité éluer un seul sphéroïde au centre de chaque puits, c’est-à-dire n’expulsez aucun milieu de la pointe de la pipette et laissez l’action capillaire retirer le sphéroïde de la pointe de la pipette. Pour confirmer l’élution, le contenu du pipetteur peut être pipeté dans la boîte de Petri de 7 cm au microscope.
        REMARQUE: L’élution par gravité d’un seul sphéroïde prend généralement 15 à 30 s en fonction de la taille / densité du sphéroïde. Pendant ce temps, le pipetteur ne doit pas être retiré. Tout puits de correction de fond doit être exempt de sphéroïdes et ne contenir que du milieu d’essai. Sous le microscope, confirmez la position de chaque sphéroïde. Chaque sphéroïde devrait idéalement être positionné au centre de chaque puits.
      2. Une fois que tous les sphéroïdes ont été transférés sur la microplaque d’essai des sphéroïdes, transférer la plaque dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant au moins 1 h avant le test.

3. Préparation et chargement des composés dans la cartouche du capteur pour les tests XF

Stratégie d’injectionComposé (port)Volume de démarrage du micropuit XFe96 (μL)Concentration finale souhaitée dans le puitsVolume du port (μL)Volume final du micropuit XFe96 après injection (μL)Concentration du stock de travail
1Oligomycine (A)1803 ug/mL2020030 μg/mL
Roténone (B)2002 μM2022022 μM
Antimycine A (B)2002 μM2022022 μM
2BAM15 (A)1805 μM2020050 μM
Roténone (B)2002 μM2022022 μM
Antimycine A (B)2002 μM2022022 μM

Tableau 2 : Concentrations de composés mitochondriaux pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide de l’analyseur XFe96.

  1. Préparer les concentrations sur le stock de travail de chaque composé, comme indiqué dans le tableau 2 , à l’aide d’un milieu d’essai XF RPMI préavertissé entièrement complété.
  2. Orientez la plaque de cartouche (couplée à la plaque utilitaire) en colonne, 1-12 de gauche à droite.
  3. Si vous utilisez un guide de chargement, placez-le sur la plaque de la cartouche conformément à la procédure de chargement du puits, par exemple, si le port A est chargé en premier, assurez-vous que A est visible dans le coin supérieur gauche du guide.
  4. Transférer la solution de travail de chaque composé dans un réservoir approprié et, à l’aide d’une pipette multicanal P100 étalonnée, distribuer 20 μL dans tous les ports correspondants. Répétez l’opération pour chaque composé dans les ports restants.
    REMARQUE: Si aucun port n’est utilisé sur la plaque de la cartouche du capteur, ceux-ci peuvent être laissés vides ou remplis de support de dosage. Si seule une sélection d’une lettre de port spécifique est utilisée, assurez-vous que les autres ports correspondant à cette lettre sont chargés avec un support d’essai; sinon, de l’air sera injecté dans le puits, compromettant les résultats dans ces puits.
  5. Après le chargement du port, retirez les guides de chargement de la plaque (le cas échéant) et préparez l’analyseur pour le chargement de la cartouche du capteur.
    REMARQUE: Si le test n’est pas exécuté immédiatement après le chargement des ports, replacez le couvercle sur la cartouche du capteur et remettez la plaque dans l’incubateur à air à 37 ° C jusqu’à ce qu’elle soit prête à charger dans la machine.

4. Conception des essais, stratégies d’injection et acquisition de données

  1. Exécution du test
    1. Mettez l’analyseur sous tension et connectez-le au contrôleur (ordinateur).
      REMARQUE: Cela peut être vérifié par l’état de la connexion de l’instrument dans le panneau de widget du logiciel Wave Controller.
    2. Accédez à la page des modèles dans le logiciel WAVE, recherchez le fichier de modèle de test de l’expérience et double-cliquez dessus pour l’ouvrir.
      Remarque : Si le modèle de test n’apparaît pas dans la vue Modèles , importez le fichier de modèle dans le dossier de modèle à partir d’un lecteur réseau partagé ou d’un lecteur flash USB.
    3. Pour démarrer le test, cliquez sur l’onglet Exécuter le test .
      REMARQUE: Si les définitions de groupe ont été correctement attribuées dans la carte des plaques, le test sera prêt à s’exécuter comme indiqué par la coche verte sur le côté droit de la page. À ce stade, toute information supplémentaire peut être saisie sur la page de résumé de l’essai ou sur la page laissée vide; passez à l’étape suivante. En raison de la pénétration retardée des modulateurs mitochondriaux dans les sphéroïdes de microtissus 3D (Figure 2), utilisez les informations du protocole de mesure décrites dans le tableau 3.
Période de mesureNuméro d’injection et portDétails de la mesureDurée de la période (h:min:s)
ÉtalonnageSans objetLes analyseurs XF effectuent toujours cet étalonnage pour s’assurer que les mesures sont précises00:20:00 (il s’agit d’une moyenne qui peut varier d’une machine à l’autre)
ÉquillibrationSans objetL’équilibrage a lieu après l’étalonnage et il est recommandé.00:10:00
BasalSans objetCycles = 500:30:00
Mélange = 3:00
Attendre = 0:00
Mesure = 3:00
Oligomycine / BAM15Injection 1 (Port A)Cycles = 1001:00:00
Mélange = 3:00
Attendre = 0:00
Mesure = 3:00
Roténone + antimycine AInjection 2 (Port B)Cycles = 1001:00:00
Mélange = 3:00
Attendre = 0:00
Mesure = 3:00
Temps total:03:00:00

Tableau 3 : Configuration du protocole pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide de l’analyseur XFe96.

  1. Cliquez sur Démarrer pour afficher la boîte de dialogue Emplacement d’enregistrement .
  2. Entrez l’emplacement d’enregistrement du fichier de résultats et placez la cartouche de capteur assemblée sur le plateau thermique qui apparaît de la porte sur le côté de l’analyseur. Attendez que le plateau thermique s’ouvre automatiquement et que l’écran affiche le message Load Calibrant Utility Plate . Avant de suivre les instructions à l’écran, assurez-vous i) que la cartouche du capteur est bien ajustée sur la plaque utilitaire, ii) que le couvercle est retiré de la cartouche du capteur et iii) que la cartouche du capteur est correctement orientée sur la plaque utilitaire.
  3. Suivez les commandes à l’écran pour lancer l’étalonnage de la cartouche du capteur.
    REMARQUE: Le temps nécessaire pour terminer l’étalonnage est d’environ 10-20 min (pour les essais à 37 ° C).
  4. Après l’étalonnage de la cartouche du capteur, chargez la microplaque sphéroïde dans l’analyseur en suivant les instructions à l’écran sur le contrôleur d’ondes pour lancer l’étape d’équilibrage de 12 minutes.
    REMARQUE: Les cases vertes avec des coches blanches indiquent un « bon » étalonnage pour ce puits. Si des puits ne fournissent pas un « bon » étalonnage, ils seront indiqués par une boîte rouge et une croix blanche. Ces puits doivent être notés et exclus de toute analyse une fois que l’essai est terminé à l’aide de l’onglet de l’essai de modification .
  5. Attendez que l’analyseur commence automatiquement à acquérir des mesures de base une fois que la machine a terminé l’étape d’équilibrage (comme indiqué dans le protocole de l’instrument).
  6. Pour terminer l’expérience, suivez les commandes à l’écran sur le contrôleur WAVE.
    REMARQUE: Une fois que la microplaque sphéroïde a été retirée de l’analyseur, jetez la cartouche du capteur et mettez de côté la plaque sphéroïde pour une analyse plus approfondie si nécessaire (par exemple, quantification de l’ADN double brin (ds)). Si la microplaque n’est pas nécessaire pour une analyse plus approfondie, elle peut être jetée avec la cartouche du capteur.
  7. Attendez que la boîte de dialogue d’analyse s’affiche et affichez les résultats ou revenez à la vue des modèles .

5. Stratégies de normalisation et d’analyse des données - normalisation post-essai et essais en aval (étapes facultatives)

  1. Normalisation des données
    1. Pour normaliser les données sphéroïdes, reportez-vous à la série de protocoles pertinents pour les stratégies de normalisation des données pour calculer la taille et le volume des sphéroïdes et quantifier l’ADNds dans les essais sphéroïdes. Ceux-ci ont été inclus en tant que fichiers supplémentaires; voir Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2.
  2. Analyse des données
    1. Pour exporter des données dans l’un des générateurs d’analyse automatisés, suivez les commandes d’exportation de données sur le contrôleur WAVE et sélectionnez le générateur d’exportation qui correspond au type de test. Vous pouvez également exporter le fichier de données et le télécharger dans Seahorse Analytics.
      REMARQUE: L’inconvénient des générateurs de rapports et de l’analyse Seahorse est que l’analyse des données est limitée à la façon dont le test XF est conçu et ne permet pas de prendre des moyennes à travers les cycles de mesure. L’exportation manuelle des jeux de données à partir du logiciel de l’instrument permet à l’utilisateur de préférer à cet égard. Étant donné que la stratégie d’injection pour évaluer la respiration mitochondriale des sphéroïdes 3D sera probablement différente de celle d’un test typique « MitoStress », une série de modèles de feuilles de calcul ont été développés pour aider à analyser ces ensembles de données, spécifiques aux cultures cellulaires 3D et seront fournis sur demande. Ces fichiers de modèles de données fourniront des données sur les principaux paramètres respiratoires mitochondriaux détaillés et expliqués à la figure 2.
    2. Pour analyser les données, exportez les données sous forme de rapport de feuille de calcul à partir du logiciel de contrôleur WAVE et utilisez un modèle de feuille de calcul indépendant pour l’analyse.

figure-protocol-25070
Figure 2 : Descripteurs schématiques pour les paramètres dérivés des analyses de données de flux extracellulaire. Abréviation : OCR = taux de consommation d’oxygène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

Pour obtenir des sphéroïdes compacts et bien formés, chaque lignée cellulaire a été optimisée individuellement pour la densité d’ensemencement et la durée de culture (figure 3). Les lignées cellulaires A549, HepG2/C3A et SK-OV-3 ont initialement formé des agrégats lâches qui n’ont progressé vers des sphéroïdes ronds avec des périmètres clairement définis qu’après 7 jours de culture. Inversement, les cellules MCF-7 pourraient former des sphéroïdes dans les 3 jours....

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Discussion

Principales constatations et extrants
Cet article fournit un protocole détaillé pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide d’une série de lignées cellulaires dérivées du cancer avec l’analyseur XFe96 XF. Une méthode est développée et décrite pour la culture rapide des sphéroïdes cellulaires A549, HepG2/C3A, MCF7 et SK-OV-3 en utilisant des technologies d’hydrofuge cellulaire pour l’agrégation forcée. Ce protocole aborde de nombr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

N.J.C a reçu un BBSRC MIBTP CASE Award avec Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
A549ECACC #86012804Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4Agilent Technologies Inc.103576-100XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux AnalyzerAgilent Technologies Inc.-Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin AMerck Life ScienceA8674Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15TOCRIS bio-techne5737Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplateGreiner Bio-One655076For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplatesGreiner Bio-One650970Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-LysineR&D Systems a biotechne brand3439-100-01Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-GlucoseMerck Life SciencesG8270Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885084Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging SystemThermo Fisher ScientificAMEX1000Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kitBiological Industries20-700-20Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image JAnalysis of collated images
Foetal bovine serumMerck Life ScienceF7524Supplement for cell culture medium
HepG2/C3AATCC #CRL-10741Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-GloPromegaJ5021Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution)Merk Life SciencesG7513Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscopeLeica MicrosytemsLEICAM50Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7ECACC#86012803Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenesMerck Life ScienceO4876ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-StreptomycinGibco15140122Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInitrogenP7589Analysis of dsDNA in spehroids
RotenoneMerck Life ScienceR8875Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640Gibco21875091Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse AnalyticsAgilent Technologies Inc.Build 421https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPakAgilent Technologies Inc.102905-100Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mLGreiner Bio-One606107; 607107; 760107Consumables for cell culture
SK-OV-3ECACC #HTB-77Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution)Merck Life ScienceS8636Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flaskGreiner Bio-One658175Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpressGibco12604-021Cell dissociation reagent
Wave controller softwareAgilent Technologies Inc.-
Wide orifice tipSTARLAB International GmbHE1011-8400Pipette tips with wide opening for spheroid handling

Références

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

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