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  • Erratum Notice
  • Riepilogo
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  • Protocollo
  • Risultati
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  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Erratum
  • Ristampe e Autorizzazioni

Erratum Notice

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Riepilogo

Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.

Abstract

Gli aggregati cellulari tridimensionali (3D), chiamati sferoidi, sono diventati l'avanguardia della coltura cellulare in vitro negli ultimi anni. A differenza della coltura delle cellule come monostrati bidimensionali a singola cellula (coltura 2D), la coltura cellulare sferoide promuove, regola e supporta l'architettura cellulare fisiologica e le caratteristiche che esistono in vivo, compresa l'espressione di proteine della matrice extracellulare, la segnalazione cellulare, l'espressione genica, la produzione di proteine, la differenziazione e la proliferazione. L'importanza della cultura 3D è stata riconosciuta in molti campi di ricerca, tra cui oncologia, diabete, biologia delle cellule staminali e ingegneria tissutale. Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati metodi migliorati per produrre sferoidi e valutare la loro funzione metabolica e il loro destino.

Gli analizzatori di flusso extracellulare (XF) sono stati utilizzati per esplorare la funzione mitocondriale in microtessuti 3D come gli sferoidi utilizzando una piastra di cattura delle isole XF24 o una micropiastra sferoide XFe96. Tuttavia, protocolli distinti e l'ottimizzazione del metabolismo energetico mitocondriale di sonda negli sferoidi utilizzando la tecnologia XF non sono stati descritti in dettaglio. Questo documento fornisce protocolli dettagliati per sondare il metabolismo energetico mitocondriale in singoli sferoidi 3D utilizzando micropiastre sferoidi con l'analizzatore XF XFe96. Utilizzando diverse linee cellulari tumorali, la tecnologia XF ha dimostrato di essere in grado di distinguere tra respirazione cellulare in sferoidi 3D non solo di diverse dimensioni, ma anche di diversi volumi, numeri di cellule, contenuto e tipo di DNA.

Le concentrazioni ottimali di composti effettori mitocondriali di oligomicina, BAM15, rotenone e antimicina A vengono utilizzate per sondare parametri specifici del metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi 3D. Questo documento discute anche i metodi per normalizzare i dati ottenuti dagli sferoidi e affronta molte considerazioni che dovrebbero essere prese in considerazione quando si esplora il metabolismo sferoide utilizzando la tecnologia XF. Questo protocollo aiuterà a guidare la ricerca in modelli sferoidi avanzati in vitro .

Introduzione

I progressi nei modelli in vitro nella ricerca biologica sono progrediti rapidamente negli ultimi 20 anni. Tali modelli ora includono modalità organ-on-a-chip, organoidi e sferoidi microtesssuei 3D, che sono diventati tutti un obiettivo comune per migliorare la traduzione tra studi in vitro e in vivo. L'uso di modelli avanzati in vitro, in particolare sferoidi, abbraccia diversi campi di ricerca, tra cui l'ingegneria tissutale, la ricerca sulle cellule staminali, il cancro e la biologia delle malattie 1,2,3,4,5,6,7 e i test di sicurezza, tra cui la tossicologia genetica 8,9,10, la tossicologia dei nanomateriali11, 12,13,14 e test di sicurezza ed efficacia dei farmaci 8,15,16,17,18,19.

La normale morfologia cellulare è fondamentale per il fenotipo e l'attività biologica. La coltivazione di cellule in sferoidi microtissuei 3D consente alle cellule di adottare una morfologia, una funzione fenotipica e un'architettura, più simile a quella osservata in vivo ma difficile da catturare con le classiche tecniche di coltura cellulare monostrato. Sia in vivo che in vitro, la funzione cellulare è direttamente influenzata dal microambiente cellulare, che non si limita alla comunicazione e alla programmazione cellulare (ad esempio, formazioni di giunzione cellula-cellula, opportunità di formare nicchie cellulari); esposizione cellulare agli ormoni e ai fattori di crescita negli ambienti immediati (ad esempio, esposizione cellulare alle citochine come parte di una risposta infiammatoria); composizione di matrici fisiche e chimiche (ad esempio, se le cellule vengono coltivate in plastica di coltura tissutale rigida o in un ambiente di tessuto elastico); e, soprattutto, come il metabolismo cellulare è influenzato dalla nutrizione e dall'accesso all'ossigeno, nonché dalla lavorazione di prodotti di scarto metabolici come l'acido lattico.

L'analisi del flusso metabolico è un modo potente per esaminare il metabolismo cellulare all'interno di sistemi in vitro definiti. In particolare, la tecnologia XF consente l'analisi di cambiamenti vivi e in tempo reale nella bioenergetica cellulare di cellule e tessuti intatti. Dato che molti eventi metabolici intracellulari si verificano nell'ordine di secondi o minuti, gli approcci funzionali in tempo reale sono fondamentali per comprendere i cambiamenti in tempo reale nel flusso metabolico cellulare in cellule e tessuti intatti in vitro.

Questo documento fornisce protocolli per la coltivazione di linee cellulari derivate dal cancro A549 (adenocarcinoma polmonare), HepG2 / C3A (carcinoma epatocellulare), MCF-7 (adenocarcinoma mammario) e SK-OV-3 (adenocarcinoma ovarico) come modelli sferoidi 3D in vitro utilizzando approcci ad aggregazione forzata (Figura 1). Inoltre (i) descrive in dettaglio come sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando l'analizzatore Agilent XFe96 XF, (ii) evidenzia i modi per ottimizzare i saggi XF utilizzando singoli sferoidi 3D e (iii) discute importanti considerazioni e limitazioni del sondaggio del metabolismo sferoide 3D utilizzando questo approccio. Ancora più importante, questo documento descrive come vengono raccolti i set di dati che consentono il calcolo del tasso di consumo di ossigeno (OCR) per determinare la fosforilazione ossidativa e quindi la funzione mitocondriale negli sferoidi cellulari. Sebbene non sia stato analizzato per questo protocollo, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) è un altro parametro che viene misurato insieme ai dati OCR negli esperimenti XF. Tuttavia, ECAR è spesso interpretato in modo errato o errato dai set di dati XF. Forniamo un commento sui limiti del calcolo dell'ECAR seguendo gli approcci di base del produttore della tecnologia.

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Protocollo

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Figura 1: Flusso di lavoro grafico per la generazione di sferoidi cellulari, analisi del flusso extracellulare e saggi a valle. Quattro linee cellulari tumorali sono state coltivate selettivamente come monostrati (A), staccate dai palloni di coltura tissutale e seminate in micropiastre a 96 pozzetti di attacco ultrabasso per formare sferoidi (B). Il carcinoma polmonare A549, il carcinoma epatico HepG2 / C3A, l'adenocarcinoma ovarico SK-OV-3 e le cellule di carcinoma mammario MCF-7 sono state seminate a 1 × 103-8 × 103 cellule / pozzetto e cresciute fino a 7 giorni per formare singoli sferoidi e ottimizzare la densità di semina degli sferoidi e il tempo di coltivazione mediante osservazione continua e misurazioni planimetriche. Una volta formati, i singoli sferoidi sono stati lavati in un mezzo XF privo di siero e accuratamente seminati in micropiastre per il dosaggio sferoidale, precolate con poli-D-lisina (C). Gli sferoidi sono stati sottoposti ad analisi del flusso extracellulare utilizzando l'analizzatore XFe96 utilizzando diversi protocolli per affrontare: (1) dimensioni sferoidi ottimali per la risposta respiratoria mitocondriale basale; (2) titolazione ottimizzata degli inibitori respiratori mitocondriali; (3) ottimizzazione del posizionamento sferoidale all'interno di pozzetti di micropiastre. (D) Le analisi post XF, la microscopia a contrasto di fase e la quantificazione del DNA sferoide sono state utilizzate per la normalizzazione dei dati e altri saggi in vitro a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Coltivazione di linee cellulari tumorali come sferoidi 3D in vitro

Linea cellulareDescrizioneTerreno di colturaFonte
A549 ·Linea cellulare di carcinoma polmonareRPMI 1640 ·Collezione europea di colture cellulari autenticate (ECACC)
Piruvato di sodio (1 mM)
Penicillina- Streptomicina - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
HepG2/C3ALinea cellulare del carcinoma epatico, un derivato clonale della linea cellulare HepG2 madreDMEM ·American Tissue Culture Collection (ATCC)
Penicillina- Streptomicina - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
MCF7 ·Linea cellulare di adenocarcinoma mammarioRPMI 1640 ·Collezione europea di colture cellulari autenticate (ECACC)
Piruvato di sodio (1 mM)
Penicillina- Streptomicina - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
SK-OV-3 ·Linea cellulare di adenocarcinoma ovaricoRPMI 1640 ·Collezione europea di colture cellulari autenticate (ECACC)
Piruvato di sodio (1 mM)
Penicillina- Streptomicina - (100 U/mL – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
ComponenteMezzo di saggio RPMI (volume finale di 50 ml)
Base MediaAgilent Cavalluccio marino XF RPMI, pH 7,4
Glucosio (1 M di brodo sterile)11 mM (0,55 mL di soluzione madre)
L-glutammina (200 mM di stock sterile)2 mM (0,5 mL di soluzione madre)
Piruvato di sodio (100 mM di stock sterile)1 mM (0,5 mL di soluzione madre)

Tabella 1: Supporti della linea cellulare tumorale e composizioni dei media XF.

  1. Coltivare tutte le linee cellulari utilizzando la tecnica standard di coltura tissutale asettica e confermare che sono prive di micoplasma utilizzando un kit di analisi adatto.
  2. Coltivare le linee cellulari in palloni di coltura tissutale T75 o equivalenti, utilizzando il mezzo raccomandato (Tabella 1). Coltivare le linee cellulari al 65-80% di confluenza e passarle regolarmente fino ad un massimo di 25 passaggi.
  3. Risciacquare due volte i palloni di coltura cellulare nella soluzione salina tamponata con fosfato modificato (DBPS) di Dulbecco.
  4. Staccare le cellule dai palloni con 3 mL del reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) per 5 minuti a 37 °C e confermare il distacco al microscopio.
  5. Aspirare delicatamente la sospensione cellulare staccata per garantire una sospensione unicellulare e disattivare il reagente di dissociazione cellulare con 7 mL di terreno di coltura tissutale completo.
  6. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 × g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere le cellule in mezzo completo.
  7. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato e titolare la densità cellulare desiderata necessaria per la semina.
    NOTA: Per seminare un'intera piastra a 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto a 4 × 103 cellule/pozzetto, le cellule devono essere titolate a 4 × 104 cellule/mL in un volume raccomandato di 12 mL.
  8. Decantare la sospensione cellulare in un serbatoio sterile ed erogare 100 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una micropiastra repellente per cellule utilizzando un pipettor multicanale.
    NOTA: solo i 60 pozzetti interni di una micropiastra devono essere seminati e il resto riempito con DPBS. Ciò formerà una barriera di evaporazione, garantirà l'omogeneità sferoide attraverso la piastra e ridurrà al minimo gli effetti del bordo della piastra.
  9. Centrifugare micropiastre sferoidi a 300 × g per 15 minuti per forzare le cellule in aggregati sciolti.
  10. Incubare le piastre a 37 °C, 5% CO2 per un minimo di 3 giorni per garantire la formazione di sferoidi.
  11. Eseguire la microscopia a contrasto di fase utilizzando pratiche di laboratorio standardizzate per monitorare la crescita degli sferoidi. Ricostituire il terreno di coltura cellulare ogni 3 giorni o due volte alla settimana eseguendo uno scambio di mezzo mezzo volume.

2. Sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi utilizzando la tecnologia Extracellular Flux (XF)

  1. Preparazione del test (un giorno prima)
    1. Controllare la vitalità sferoidale utilizzando un microscopio a luce invertita con contrasto di fase con ingrandimento 4x per garantire la struttura sferoide intatta, la morfologia e l'uniformità generale tra i campioni.
    2. Idratare la cartuccia del sensore.
      1. Aliquota ~20 mL del calibrante in un tubo conico.
      2. Posizionare il tubo conico contenente il calibrante in un incubatore non CO2 a 37 °C durante la notte.
      3. Rimuovere il contenuto dal kit di analisi.
      4. Rimuovere la cartuccia del sensore dalla piastra di utilità e posizionarla a testa in giù sul piano di lavoro accanto alla piastra di utilità.
      5. Pipettare 200 μL di ddH2O sterile in ciascun pozzetto della piastra di utilità della cartuccia del sensore utilizzando una pipetta P300 multicanale.
      6. Posizionare la cartuccia del sensore sulla parte superiore della piastra di utilità.
      7. Verificare che il livello dell'acqua in ciascun pozzo sia sufficientemente alto da immergere le sonde del sensore.
      8. Trasferire la cartuccia del sensore assemblata in un incubatore non CO2 a 37 °C e lasciarla per una notte.
        NOTA: questo passaggio può essere eseguito 12-72 ore prima dell'inizio del test.
  2. Micropiastra per analisi sferoide del mantello
    1. Utilizzando tecniche asettiche, aggiungere 30 μL/pozzetto di soluzione sterile di Poli-D-Lisina (0,1 mg/mL) alla micropiastra sferoide e incubarla per 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Aspirare la soluzione da ciascun pozzetto della micropiastra sferoidale, invertire la piastra e picchiettarla saldamente sulla carta velina per rimuovere qualsiasi soluzione residua.
    3. Lavare la piastra due volte con 200 μL/pozzetto di ddH2O sterile.
    4. Dopo il lavaggio finale, capovolgere la micropiastra e picchiettarla saldamente sulla carta velina per rimuovere l'acqua residua.
    5. Lasciare asciugare la piastra all'aria per 30 minuti prima di utilizzarla o conservarla a 4 °C per un uso futuro.
      NOTA: La micropiastra per il dosaggio dello sferoide deve essere rivestita con un adesivo molecolare per garantire che gli sferoidi siano fissati sul fondo della micropiastra. Senza un adesivo molecolare, gli sferoidi possono essere rimossi e interferire con i risultati del test. Altri adesivi molecolari possono anche essere utilizzati come alternativa alla poli-D-lisina per le piastre di precoating. Le piastre precoate possono essere conservate a 4 °C, ma devono essere lasciate in equilibrio a temperatura ambiente prima dell'inizio del test.
  3. Preparare il mezzo di analisi XF
    1. Preparare il mezzo RPMI XF, come descritto nella Tabella 1, e il filtro sterile con un filtro a siringa da 0,22 μm
  4. Preparazione del test (1 ora prima del test)
    1. Preriscaldare il mezzo di saggio XF RPMI integrato a 37 °C.
    2. Preriscaldare la micropiastra di analisi sferoidale rivestita in un incubatore non CO2 a 37 °C o in un bagno secco.
    3. Preparare la cartuccia del sensore.
      1. Estrarre il tubo conico contenente il calibrante e la cartuccia del sensore dall'incubatore ad aria.
      2. Rimuovere la cartuccia del sensore dalla piastra di utilità e posizionarla a testa in giù sul piano di lavoro.
      3. Utilizzando una pipetta multicanale P300, aspirare l'acqua dalla piastra di servizio e scartarla.
      4. Versare la soluzione di calibrante in un serbatoio di reagente sterile e aggiungere 200 μL/pozzetto del calibrante preriscaldato alla piastra di servizio utilizzando una pipetta multicanale P300.
      5. Prelevare la cartuccia del sensore e riposizionarla sopra la piastra di utilità, assicurandosi che i sensori siano ben immersi nel calibrante.
      6. Trasferire nuovamente la cartuccia del sensore assemblata nell'incubatore non CO2 a 37 °C fino a quando non sarà pronta per caricare le soluzioni di iniezione della porta.
  5. Lavare gli sferoidi con il mezzo di analisi.
    1. Rimuovere la piastra di coltura sferoidale dall'incubatore a 37 °C, 5% CO2 e osservare gli sferoidi al microscopio per garantirne l'integrità prima delle fasi di trasferimento dello sferoide.
    2. Caricare tutti i pozzetti della piastra sferoidale con 180 μL/pozzetto di terreno di saggio preriscaldato, compresi eventuali pozzetti di correzione dello sfondo.
    3. Riempire parzialmente una capsula di Petri di 7 cm con 3 ml del mezzo di saggio.
    4. Utilizzando una pipetta multicanale caricata con ampie punte di pipetta orifizio, trasferire gli sferoidi dalla piastra di coltura a 96 pozzetti in piastre di Petri da 7 cm impostando il pipettor a un volume di aspirazione di 10-50 μL.
  6. Sferoidi di semi nella micropiastra di analisi sferoidale pre-rivestita.
    1. Utilizzando un microscopio di dissezione e un apparecchio lightbox, trasferire gli sferoidi dalla capsula di Petri alla micropiastra di saggio sferoidale come descritto di seguito.
      1. Impostare il volume di un pipettor a canale singolo dotato di un'ampia punta della pipetta dell'orifizio a 20 μL e aspirare accuratamente un singolo sferoide. Posizionare la punta direttamente al centro di ciascun pozzetto della micropiastra di saggio sferoidale e consentire alla gravità di eluire un singolo sferoide nel centro di ciascun pozzetto, ovvero non espellere alcun mezzo dalla punta della pipetta e consentire l'azione capillare per prelevare lo sferoide dalla punta della pipetta. Per confermare l'eluizione, il contenuto del pipettor può essere reintubato nella capsula di Petri da 7 cm al microscopio.
        NOTA: l'eluizione gravitazionale di un singolo sferoide richiede in genere 15-30 s a seconda delle dimensioni / densità dello sferoide. Durante questo periodo, il pipettor non deve essere rimosso. Qualsiasi pozzetto di correzione dello sfondo deve essere privo di sferoidi e contenere solo un mezzo di analisi. Al microscopio, confermare la posizione di ciascun sferoide. Ogni sferoide dovrebbe idealmente essere posizionato all'interno del centro di ciascun pozzetto.
      2. Una volta che tutti gli sferoidi sono stati trasferiti nella micropiastra di analisi sferoidale, trasferire la piastra in un incubatore non CO2 a 37 °C per un minimo di 1 ora prima del test.

3. Preparazione e caricamento dei composti nella cartuccia del sensore per i saggi XF

Strategia di iniezioneCompound (Porto)Volume iniziale del microwell XFe96 (μL)Concentrazione finale del pozzo desiderataVolume della porta (μL)Volume finale del microwell XFe96 post iniezione (μL)Concentrazione delle scorte di lavoro
1Oligomicina (A)1803 ug/mL2020030 μg/mL
Rotenone (B)2002 μM2022022 μM
Antimicina A (B)2002 μM2022022 μM
2BAM15 (A)1805 μM2020050 μM
Rotenone (B)2002 μM2022022 μM
Antimicina A (B)2002 μM2022022 μM

Tabella 2: Concentrazioni di composti mitocondriali per sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando l'analizzatore XFe96.

  1. Preparare le concentrazioni di magazzino di ciascun composto come indicato nella Tabella 2 utilizzando un mezzo di saggio RPMI XF completamente integrato e preriscaldato.
  2. Orientare la piastra della cartuccia (accoppiata alla piastra di utilità) in base alla colonna, 1-12 da sinistra a destra.
  3. Se si utilizza una guida di carico, posizionarla sopra la piastra della cartuccia in base alla procedura di caricamento del pozzo, ad esempio, se la porta A viene caricata per prima, assicurarsi che A sia visibile nell'angolo in alto a sinistra della guida.
  4. Trasferire la soluzione di lavoro di ciascun composto in un serbatoio adatto e, utilizzando una pipetta multicanale P100 calibrata, erogare 20 μL in tutte le porte corrispondenti. Ripetere l'operazione per ogni composto nelle porte rimanenti.
    NOTA: se non vengono utilizzate porte sulla piastra della cartuccia del sensore, queste possono essere lasciate vuote o riempite con il supporto di analisi. Se viene utilizzata solo una selezione di una specifica lettera di porta, assicurarsi che le altre porte corrispondenti a tale lettera siano caricate con un supporto di analisi; in caso contrario, l'aria verrà iniettata nel pozzo, compromettendo i risultati in quei pozzi.
  5. Dopo il caricamento della porta, rimuovere le guide di caricamento delle piastre (se utilizzate) e preparare l'analizzatore per il caricamento della cartuccia del sensore.
    NOTA: se il test non viene eseguito immediatamente dopo aver caricato le porte, riposizionare il coperchio sulla cartuccia del sensore e rimettere la piastra nell'incubatore ad aria a 37 °C fino a quando non sarà pronta per essere caricata nella macchina.

4. Progettazione del test, strategie di iniezione e acquisizione dati

  1. Esecuzione del test
    1. Accendere l'analizzatore e collegarlo al controller (computer).
      NOTA: questo può essere verificato dallo stato della connessione dello strumento nel pannello widget del software Wave Controller.
    2. Passare alla pagina dei modelli nel software WAVE, trovare il file del modello di analisi per l'esperimento e fare doppio clic per aprirlo.
      NOTA: se il modello di analisi non viene visualizzato nella vista Modelli , importare il file modello nella cartella del modello da un'unità di rete condivisa o da un'unità flash USB.
    3. Per avviare il test, fare clic sulla scheda Esegui test .
      NOTA: se le definizioni di gruppo sono state allocate correttamente all'interno della mappa della piastra, il test sarà pronto per essere eseguito come indicato dal segno di spunta verde sul lato destro della pagina. In questa fase, qualsiasi informazione aggiuntiva può essere inserita nella pagina di riepilogo del test o nella pagina lasciata vuota; procedere al passaggio successivo. A causa della penetrazione ritardata dei modulatori mitocondriali negli sferoidi microtissue 3D (Figura 2), utilizzare le informazioni sul protocollo di misurazione descritte nella Tabella 3.
Periodo di misurazioneNumero di iniezione e portaDettagli di misurazioneDurata del periodo (h:min:s)
TaraturaNon applicabileGli analizzatori XF eseguono sempre questa calibrazione per assicurarsi che le misurazioni siano accurate00:20:00 (questa è una media e può variare tra le macchine)
EquillibrazioneNon applicabileL'equilibrio avviene dopo la calibrazione ed è raccomandato.00:10:00
BasaleNon applicabileCicli = 500:30:00
Mix = 3:00
Attendi = 0:00
Misura = 3:00
Oligomicina / BAM15Iniezione 1 (Porta A)Cicli = 1001:00:00
Mix = 3:00
Attendi = 0:00
Misura = 3:00
Rotenone + antimicina AIniezione 2 (Porta B)Cicli = 1001:00:00
Mix = 3:00
Attendi = 0:00
Misura = 3:00
Tempo totale:03:00:00

Tabella 3: Configurazione del protocollo per sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando l'analizzatore XFe96.

  1. Fare clic su Avvia esecuzione per visualizzare la finestra di dialogo Salva percorso .
  2. Immettere la posizione di salvataggio per il file dei risultati e posizionare la cartuccia del sensore assemblata sul vassoio termico che appare dalla porta sul lato dell'analizzatore. Attendere che il vassoio termico si apra automaticamente e che sullo schermo venga visualizzato il messaggio Load Calibrant Utility Plate . Prima di seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo, assicurarsi i) il corretto adattamento della cartuccia del sensore sulla piastra dell'utilità, ii) che il coperchio venga rimosso dalla cartuccia del sensore e iii) il corretto orientamento della cartuccia del sensore sulla piastra dell'utilità.
  3. Seguire i comandi sullo schermo per avviare la calibrazione della cartuccia del sensore.
    NOTA: Il tempo necessario per completare la calibrazione è di circa 10-20 minuti (per saggi a 37 °C).
  4. Dopo la calibrazione della cartuccia del sensore, caricare la micropiastra sferoide nell'analizzatore seguendo le istruzioni visualizzate sullo schermo sul Wave Controller per avviare la fase di bilanciamento di 12 minuti.
    NOTA: le caselle verdi con segni di spunta bianchi indicano una calibrazione "buona" per quel pozzo. Se alcuni pozzi non riescono a fornire una calibrazione "buona", saranno indicati con una scatola rossa e una croce bianca. Tali pozzi devono essere annotati ed esclusi da qualsiasi analisi dopo che il test è stato completato utilizzando la scheda del test di modifica .
  5. Attendere che l'analizzatore inizi automaticamente ad acquisire le misurazioni di base dopo che la macchina ha completato la fase di equilibratura (come indicato nel protocollo dello strumento).
  6. Per completare l'esperimento, seguire i comandi sullo schermo sul controller WAVE.
    NOTA: una volta che la micropiastra sferoidale è stata rimossa dall'analizzatore, scartare la cartuccia del sensore e mettere da parte la piastra sferoide per ulteriori analisi, se necessario (ad esempio, quantificazione del DNA a doppio filamento (ds).) Se la micropiastra non è necessaria per ulteriori analisi, può essere scartata insieme alla cartuccia del sensore.
  7. Attendere la visualizzazione della finestra di dialogo del test e visualizzare i risultati o tornare alla visualizzazione dei modelli .

5. Strategie di normalizzazione e analisi dei dati - normalizzazione post-test e saggi a valle (passaggi facoltativi)

  1. Normalizzazione dei dati
    1. Per normalizzare i dati sferoidi, fare riferimento alla serie di protocolli pertinenti alle strategie di normalizzazione dei dati per il calcolo delle dimensioni e del volume degli sferoidi e la quantificazione del dsDNA nei saggi sferoidi. Questi sono stati inclusi come file supplementari; vedere Il file supplementare 1 e il file supplementare 2.
  2. Analisi dei dati
    1. Per esportare i dati in uno dei generatori di analisi automatizzati, seguire i comandi di esportazione dei dati sul controller WAVE e selezionare il generatore di esportazione che corrisponde al tipo di test. In alternativa, esporta il file di dati e caricalo in Seahorse Analytics.
      NOTA: lo svantaggio dei generatori di report e dell'analisi Seahorse è che l'analisi dei dati è limitata al modo in cui è progettato il test XF e non consente di prendere le medie tra i cicli di misurazione. L'esportazione manuale dei set di dati dal software dello strumento consente la preferenza dell'utente a questo proposito. Dato che la strategia di iniezione per valutare la respirazione mitocondriale degli sferoidi 3D sarà probabilmente diversa da quella di un tipico test "MitoStress", sono stati sviluppati una serie di modelli di fogli di calcolo per aiutare ad analizzare questi set di dati, specifici per le colture cellulari 3D e saranno forniti su richiesta. Questi file modello di dati forniranno dati sui principali parametri respiratori mitocondriali dettagliati e spiegati nella Figura 2.
    2. Per analizzare i dati, esportare i dati come report del foglio di calcolo dal software del controller WAVE e utilizzare un modello di foglio di calcolo indipendente per l'analisi.

figure-protocol-25202
Figura 2: Descrittori schematici per parametri derivati da analisi di dati di flusso extracellulare. Abbreviazione: OCR = tasso di consumo di ossigeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Per ottenere sferoidi compatti e ben formati, ogni linea cellulare è stata ottimizzata individualmente per la densità di semina e la durata della coltivazione (Figura 3). Le linee cellulari A549, HepG2/C3A e SK-OV-3 inizialmente formavano aggregati sciolti che non progredivano verso sferoidi rotondi con perimetri chiaramente definiti fino a dopo 7 giorni in coltura. Al contrario, le cellule MCF-7 potrebbero formare sferoidi entro 3 giorni. C'era una chiara correlazione tra la densità iniz...

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Discussione

Principali risultati e realizzazioni
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando una serie di linee cellulari derivate dal cancro con l'analizzatore XF XFe96. Viene sviluppato e descritto un metodo per la rapida coltivazione di sferoidi cellulari A549, HepG2/C3A, MCF7 e SK-OV-3 utilizzando tecnologie cellorepellenti per l'aggregazione forzata. Questo protocollo affronta molte considerazioni sulla sonda del m...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

N.J.C è stato supportato da un BBSRC MIBTP CASE Award con Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
A549ECACC #86012804Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4Agilent Technologies Inc.103576-100XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux AnalyzerAgilent Technologies Inc.-Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin AMerck Life ScienceA8674Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15TOCRIS bio-techne5737Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplateGreiner Bio-One655076For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplatesGreiner Bio-One650970Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-LysineR&D Systems a biotechne brand3439-100-01Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-GlucoseMerck Life SciencesG8270Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885084Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging SystemThermo Fisher ScientificAMEX1000Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kitBiological Industries20-700-20Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image JAnalysis of collated images
Foetal bovine serumMerck Life ScienceF7524Supplement for cell culture medium
HepG2/C3AATCC #CRL-10741Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-GloPromegaJ5021Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution)Merk Life SciencesG7513Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscopeLeica MicrosytemsLEICAM50Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7ECACC#86012803Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenesMerck Life ScienceO4876ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-StreptomycinGibco15140122Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInitrogenP7589Analysis of dsDNA in spehroids
RotenoneMerck Life ScienceR8875Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640Gibco21875091Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse AnalyticsAgilent Technologies Inc.Build 421https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPakAgilent Technologies Inc.102905-100Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mLGreiner Bio-One606107; 607107; 760107Consumables for cell culture
SK-OV-3ECACC #HTB-77Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution)Merck Life ScienceS8636Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flaskGreiner Bio-One658175Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpressGibco12604-021Cell dissociation reagent
Wave controller softwareAgilent Technologies Inc.-
Wide orifice tipSTARLAB International GmbHE1011-8400Pipette tips with wide opening for spheroid handling

Riferimenti

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

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