Analyse spatio-temporelle de l’activité microgliale Ca2+ à une résolution de cellule unique

Résumé

Dans cet article, nous décrivons un protocole d’imagerie in vivo de l’activité microgliale Ca²⁺ et l’analyse ultérieure de sa dynamique spatio-temporelle. Cette méthode permet une caractérisation approfondie de la façon dont les microglies réagissent aux changements de l’environnement cérébral, en capturant de manière appropriée les fines échelles spatio-temporelles auxquelles de tels événements se produisent.

Résumé

Les microglies sont les seules cellules immunitaires résidentes du système nerveux central. Leur morphologie est très plastique, changeant en fonction de leur activité. Dans des conditions homéostatiques, les microglies possèdent une morphologie très ramifiée. Cela facilite leur surveillance de l’environnement environnant grâce à l’extension et à la rétraction continues de leurs processus. Cependant, lors de lésions cérébrales et d’inflammation, les microglies s’activent et subissent des changements morphologiques spectaculaires, rétractant leurs processus ramifiés et gonflant leur corps cellulaire. Cela facilite des activités telles que la migration et la phagocytose, que les microglies entreprennent pour naviguer dans l’environnement cérébral vers un état moins pathologique.

Cette relation étroite entre la morphologie microgliale et les changements dans leur activité a permis de mieux comprendre diverses fonctions microgliales. Cependant, de tels changements morphologiques et d’activité sont eux-mêmes des phénomènes qui peuvent résulter d’un certain nombre de voies de signalisation intracellulaires. De plus, le décalage temporel entre le stimulus et la réponse, ainsi que la morphologie fortement compartimentée de la microglie, rendent difficile l’isolement des mécanismes causaux qui sous-tendent la fonction. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une lignée de souris génétiquement modifiée dans laquelle une protéine indicatrice fluorescente Ca²⁺ très sensible est spécifiquement exprimée dans la microglie.

Après avoir décrit les méthodes d’imagerie microgliale Ca ²⁺ in vivo, cet article présente une approche d’analyse structurée qui classe cette activité Ca²⁺ dans des régions subcellulaires rationnellement définies, garantissant ainsi que les dimensions spatiales et temporelles de l’information codée sont extraites de manière significative. Nous croyons que cette approche fournira une compréhension détaillée des règles de signalisation intracellulaire qui régissent la diversité des activités microgliales associées à la fois aux fonctions cérébrales supérieures et aux conditions pathologiques.

Introduction

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) et jouent un rôle important dans le maintien d’un environnement cérébral homéostatique et dans la régulation de la formation des circuits neuronaux au cours du développement cérébral ^1,2. Une caractéristique unique des microglies dans le SNC est que leur morphologie est très plastique ; Cependant, des phénotypes morphologiques distincts peuvent être associés à des fonctions particulières. De plus, la transformation entre les phénotypes morphologiques est très dynamique, se produisant sur des échelles de temps rapides en réponse aux changements de l’environnement environnant ^3,4.

Dans des conditions physiologiques homéostatiques, la microglie adopte une morphologie très ramifiée, avec de multiples processus rayonnant vers l’extérieur dans toutes les directions. Ces processus ramifiés présentent eux-mêmes une motilité élevée, s’étendant^{et se} rétractant continuellement3,4. Une telle activité est principalement dirigée vers le contact périodique avec les synapses neuronales, les axones et les somas pour surveiller l’activité neuronale 5,6,7,8,9. Cependant, lorsque le cerveau est blessé, les microglies détectent rapidement cette anomalie et, comme première étape de leur réponse adaptative, dirigent l’extension de leurs processus vers la région correspondante ^3,4. Lorsque les microglies sont nécessaires pour entreprendre la phagocytose des cellules mortes et des métabolites, elles adoptent une morphologie semblable à celle des amiboïdes, raccourcissant leurs processus et élargissant leurs corps cellulaires, dans le cadre de leur transition vers le phénotype^10,11 activé par l’immunologie.

Cependant, alors que les changements morphologiques spectaculaires des processus microgliaux sont facilement détectés, les changements d’échelle plus fins du soma cellulaire sont nettement plus difficiles à capturer, en particulier à une résolution temporelle physiologiquement pertinente. De plus, les changements morphologiques eux-mêmes ne représentent que le résultat intégré d’un certain nombre de voies de signalisation intracellulaires. Ceci est problématique dans le but de suivre l’activité fonctionnelle et de relier mécaniquement un stimulus à la réponse finale qu’il provoque.

Compte tenu de son rôle répandu en tant que second messager, l’examen de la dynamique intracellulaire du Ca²⁺ permet de mieux saisir les informations spatio-temporelles associées lors de l’étude des processus cellulaires dynamiques. Une telle approche est applicable aux microglies étant donné qu’elles expriment une variété de récepteurs ionotropes et métabotropiques liés à l’élévation intracellulaire en aval de Ca²⁺. En effet, l’imagerie in vivo Ca²⁺ a été utilisée pour caractériser les aspects spatio-temporels des activités microgliales en temps réel, corrélant avec succès les changements de l’activité microgliale Ca²⁺ avec les lésions cérébrales, l’inflammation et l’hyperactivité et l’hypoactivité dans les neurones 12,13,14,15,16. Par exemple, les élévations de Ca²⁺ associées à l’extension du processus microglial en réponse à une activité neuronale hyper/hypoactive reflètent probablement le processus de polymérisation de l’actine dépendant du Ca^{2+ 16}. De plus, l’imagerie in vivo Ca²⁺ peut également être facilement combinée avec des approches pharmacologiques. Par exemple, alors que les microglies expriment à la fois les récepteurs P2X (ionotropiques) et P2Y (métabotropiques), l’application locale d’agonistes P2Y imite et désensibilise par la suite la réponse microgliale Ca²⁺ aux neurones voisins endommagés¹³, ce qui implique une plus grande pertinence de la signalisation P2Y pour la détection des lésions neuronales.

À ce jour, des rapports antérieurs examinant l’activité microgliale du Ca²⁺ ont utilisé des méthodes d’analyse basées sur la région d’intérêt (ROI). Un inconvénient de ces approches est qu’elles sont encore trop grossières pour pouvoir résoudre la dynamique spatio-temporelle de l’activité de Ca²⁺ au niveau des processus microgliaux individuels. Ainsi, ce protocole décrit à la fois les méthodes conventionnelles basées sur le retour sur investissement pour analyser l’activité microgliale Ca²⁺ et les nouvelles approches basées sur les événements, qui peuvent extraire des événements individuels Ca²⁺ dans les processus microgliaux. Avant cela, nous fournissons un guide général pour l’imagerie à deux photons in vivo afin de capturer de manière appropriée l’activité microgliale Ca²⁺ pour une analyse détaillée.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par les comités de recherche animale de l’Institut national des sciences physiologiques et étaient conformes aux directives des National Institutes of Health. Pour toutes les expériences, des souris mâles âgées de 8 à 10 semaines ont été élevées sous un cycle lumière/obscurité de 12/12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Pour visualiser l’activité du Ca²⁺ dans la microglie, des souris ionisées Iba1-tTA ont été croisées avec des souris ^17,18 de l’opérateur de tétracycline GCaMP6 (tetO-GCaMP6). Ainsi, en l’absence de supplémentation en analogue de la tétracycline, le promoteur d’Iba1 pilote l’expression de GCaMP6, exclusivement dans la microglie. Pour toutes les expériences, la supplémentation alimentaire en doxycycline a été arrêtée à 6 semaines après la naissance. À la fin de toutes les expériences, les souris ont été euthanasiées par surdosage d’isoflurane suivi d’une luxation cervicale. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, animaux et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Préparation chirurgicale de souris pour l’imagerie in vivo à deux photons ; Jour 1

1. Effectuez toutes les interventions chirurgicales à l’intérieur d’une armoire à flux d’air laminaire pour maintenir des conditions de travail stériles. Avant de commencer l’opération, stérilisez l’intérieur de l’armoire avec de la lumière UV pendant 5 minutes.
2. Stérilisez toutes les surfaces de travail, le cadre du cabinet et les instruments stéréotaxiques en les essuyant avec de l’éthanol à 70 %.
3. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, lame de rasoir, pince à épiler) et la plaque frontale sur mesure à fixer sur le crâne de la souris en les immergeant dans une solution de gluconate de chlorhexidine à 1 %.
4. Anesthésier la souris avec de la kétamine (7,4 mg kg⁻¹, par voie intrapéritonéale [i.p.]) et de la xylazine (10 mg kg⁻¹, i.p.). Remettez-le dans sa cage d’origine jusqu’à ce que l’anesthésie s’installe. Confirmer l’induction complète de l’anesthésie par la perte du réflexe de pincement des orteils.
5. Stérilisez le cuir chevelu avec du gluconate de chlorhexidine à 1 %. Rasez la fourrure avec une lame de rasoir.
6. Fixez la souris dans le cadre chirurgical à l’aide d’instruments stéréotaxiques.
7. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
8. Appliquez de la gelée de xylocaïne à 2 % sur le cuir chevelu pour la gestion de la douleur. Attendez 5 min.
9. Retirez le cuir chevelu avec des ciseaux et exposez le crâne. Nettoyez le périoste et séchez la surface exposée du crâne en frottant avec des cotons-tiges.
   REMARQUE : Les zones exposées du crâne doivent être complètement sèches pour assurer une liaison solide avec la plaque de tête sur mesure.
10. Fixez la plaque de tête sur mesure au crâne avec du ciment dentaire.
11. Une fois que le ciment a pris, remplissez tous les espaces entre la surface du crâne et les bords de la plaque de tête sur mesure avec du ciment dentaire supplémentaire.
12. Imperméabilisez les surfaces du ciment et du crâne en appliquant du ciment résine adhésif dentaire à base d’acrylique.
13. Remettez la souris dans sa cage d’origine, en la plaçant sur un coussin chauffant. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle retrouve une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal (dans les 2 heures).
    REMARQUE : Les souris doivent être complètement rétablies le lendemain et peuvent ensuite être hébergées avec d’autres animaux.

2. Préparation chirurgicale de souris pour l’imagerie in vivo à deux photons ; Jour 2

1. Effectuez toutes les interventions chirurgicales à l’intérieur d’une armoire à flux d’air laminaire pour maintenir des conditions de travail stériles. Avant de commencer l’opération, stérilisez l’intérieur de l’armoire avec de la lumière UV pendant 5 minutes.
2. Laminez ensemble deux lamelles en verre de dimensions différentes (verre supérieur : 3 mm × 3 mm ; verre inférieur : 2 mm × 2 mm) avec de la résine de qualité optique durcissable aux UV.
   REMARQUE : La double lamelle offre une protection à long terme à la région du cerveau exposée par la fenêtre crânienne tout en permettant un accès optique chronique. Ainsi, ses dimensions peuvent être modifiées pour s’adapter à la région du cerveau à imager.
3. Stérilisez toutes les surfaces de travail et le cadre du cabinet en les essuyant avec de l’éthanol à 70 %.
4. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux (perceuse en acier, pince à épiler, crochet à aiguille chirurgicale) en les immergeant dans une solution de gluconate de chlorhexidine à 1 %.
5. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (4 % d’induction, 1,2 % à 1,5 % d’entretien). Fixez la souris dans le cadre de l’opération via sa plaque de tête.
6. Pour créer une fenêtre crânienne sur le cortex moteur primaire, marquez un carré de 2 mm × 2 mm centré à 0,2 mm en avant et à 1 mm latéralement du point de repère du crâne de Bregma.
7. Amincissez le crâne le long du bord du carré marqué à l’aide de la perceuse en acier.
   REMARQUE : Lorsqu’ils sont proches de l’épaisseur souhaitée, les zones du crâne amincies apparaîtront transparentes lorsqu’elles seront mouillées avec une solution saline, et des fissures capillaires commenceront à apparaître.
8. Après avoir vérifié que toute la bordure du carré marqué a été correctement amincie, insérez soigneusement le crochet de l’aiguille chirurgicale juste sous la surface du crâne, en orientant sa pointe vers le centre du carré. Soulevez doucement le morceau carré du crâne avec le crochet et utilisez une pince à épiler pour le décoller du reste du crâne. En cas de saignement, lavez continuellement la surface du cerveau exposée avec une solution saline jusqu’à ce qu’elle disparaisse complètement.
9. Placez la lamelle double sur la surface exposée du cerveau, en orientant le côté avec la plus petite lamelle vers le cerveau. Assurez-vous que les bords de la plus grande lamelle sont en contact avec les bords de la fenêtre crânienne.
10. À l’aide d’une tige de verre à pointe de silicium montée dans un manipulateur, appuyez doucement sur la lamelle double pour vous assurer qu’elle entre bien en contact avec la surface du cerveau.
11. Remplissez l’espace entre la double lamelle, le crâne et la surface du cerveau avec de la résine durcissable aux UV et irradiez avec de la lumière UV jusqu’à ce qu’elle durcisse (~20 s). Soulevez lentement la tige de verre à pointe de silicium pour l’éloigner de la lamelle double.
12. Laissez la souris récupérer en la plaçant sur un coussin chauffant. Surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle retrouve une conscience suffisante pour maintenir sa position couchée sternale (30 min).
13. Passez à l’étape 3 ou remettez la souris dans sa cage d’origine.
    REMARQUE : Après une intervention chirurgicale efficace, la dure-mère et tous les vaisseaux sanguins sous-jacents seront complètement intacts sans saignement. Dans ce cas, l’inflammation est minime et il est possible de passer immédiatement à l’étape 3. En cas de doute, attendez 1 à 3 semaines pour vous assurer que toute inflammation est complètement résolue.

3. Collecte de données à l’aide de l’imagerie in vivo à deux photons

1. Allumez la configuration d’imagerie à l’avance pour vous assurer que le laser a suffisamment de temps pour se réchauffer et se stabiliser. Réglez le laser pour qu’il émette à une longueur d’onde de 920 nm, qui est le spectre à deux photons qui excite de manière optimale le fluorophore GCaMP6.
2. Placez la souris sous l’objectif d’un microscope 25x et habituez-la pendant 30 min. Si nécessaire, anesthésier la souris avec de l’isoflurane pendant l’imagerie (4 % d’induction, 1,2 % à 1,5 % d’entretien).
   REMARQUE : L’isoflurane peut ne pas convenir à certaines applications de recherche, car il affecte la motilité du processus microglial et l’activité Ca²⁺ 19,20,21.
3. Réglez le zoom sur 1x, puis recherchez les microglies exprimant GCaMP6 dans la zone de la fenêtre crânienne. Cherchez à une profondeur comprise entre 100 et 300 m sous la surface du cerveau.
4. Une fois qu’une microglie exprimant GCaMP6 appropriée a été trouvée, maximisez le zoom afin que l’activité de Ca²⁺ puisse être capturée avec une résolution de cellule unique.
5. Vérifiez visuellement que l’activité Ca²⁺ est clairement capturée et ajustez la puissance du laser et le gain d’image si nécessaire.
   REMARQUE : La puissance du laser doit être minimisée autant que possible pour éviter le photoblanchiment et les lésions de la microglie.
6. Effectuez l’acquisition d’images quadridimensionnelles (4D) comme suit (étapes 3.6.1-3.6.3 ; Figure 1B) :
   1. Réglez les dimensions de l’image sur la zone XY = 512 × 512 pixels, 0,25 μm/pixel ; Aire Z = cinq plans z, pas z de 3 μm (Figure 1B).
   2. Réglez le taux d’acquisition sur 2,5 images/s.
      REMARQUE : Le balayage en Z à cette vitesse est facilité par un système de nano-positionnement piézoélectrique.
   3. Acquérir des données jusqu’à ce qu’au moins 10 événements individuels Ca²⁺ soient observés (généralement 10 min).

4. Préparation à l’analyse (correction de mouvement, projection z moyenne/max)

1. Avant de procéder à l’analyse de l’activité microgliale Ca²⁺ , corrigez les images 4D pour détecter les artefacts liés au mouvement (recalage d’images) à l’aide de l’algorithme d’alignement d’images ECC²² dans l’environnement de programmation MATLAB (R2020a). Téléchargez le code à partir de : https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/27253-ecc-image-alignment-algorithm-image-registration.
2. Créez une image 3D de référence en enregistrant toutes les images dans la première période à l’aide de l’opération imregister MATLAB (boîte à outils de traitement d’images standard).
3. Enregistrez toutes les images suivantes, en les faisant correspondre avec le plan z correspondant de l’image 3D de référence à l’aide de la fonction ecc (bibliothèque d’algorithmes d’alignement d’images ECC).
4. Générez des projections z d’intensité moyenne à partir des images enregistrées à l’aide de l’opération MATLAB moyenne . Si le signal d’imagerie est trop faible, générez plutôt des projections z d’intensité maximale en utilisant l’opération MATLAB max .
   REMARQUE : Le rapport signal/bruit est moins bon lors de l’utilisation de projections z d’intensité maximale.
5. Passez à l’étape 5 ou 6. Utilisez les projections z générées à l’étape 4 comme cible d’analyse pour cartographier la dynamique spatio-temporelle de l’activité Ca²⁺ aux étapes 5 et 6.

5. Analyse basée sur le retour sur investissement

1. À l’aide des projections z générées à l’étape 4, identifiez les processus microgliaux qui maintiennent un profil de zone stable (zone stable) tout au long de la période d’imagerie pour une analyse ultérieure de l’activité Ca²⁺ comme suit (étapes 5.3-5.6) :
   1. Générez des projections t d’intensité maximale distinctes des images 4D enregistrées à partir d’échantillons de 2 minutes prélevés au début et à la fin de la période d’imagerie à l’aide de l’opération MATLAB max .
   2. Binariser les projections t pour générer des polygones de la morphologie microgliale correspondant au début et à la fin de la période d’imagerie à l’aide de l’opération imbinariser MATLAB. Utilisez le seuil par défaut défini automatiquement.
      REMARQUE : Si le signal Ca²⁺ est faible au début et à la fin de la période d’imagerie, la binarisation peut générer des polygones avec des bordures manquantes. Dans ce cas, dessinez manuellement les bordures manquantes à l’aide de l’outil crayon d’ImageJ.
   3. Superposez les polygones de projection t à l’aide de l’opération MATLAB imadd . La ou les régions qui se chevauchent représentent la zone stable (figure 2B).
   4. Dans les zones stables identifiées, utilisez l’opération MATLAB drawpolygon pour définir et tracer manuellement les retours sur investissement de chacun des processus microgliaux primaires et de toutes les sous-branches de second ordre évidentes.
2. Suivez les intensités de fluorescence absolues moyennes sur un retour sur investissement individuel sur toutes les périodes (Figure 2C,D).
3. À partir de la série chronologique des intensités absolues de fluorescence, calculer la variation relative de l’intensité de fluorescence (ΔF/F) selon l’équation (1). Cette série chronologique représente la dynamique microgliale normalisée du Ca²⁺ au niveau des ROI individuels.
   ΔF/F = (F(t) - F₀) / F₀ (1)
   Où F(t) est l’intensité de fluorescence enregistrée à un moment donné et F0 est le 10^e centile de l’intensité de fluorescence dans toutes les périodes de temps (Figure 2E).
4. Identifiez les événements de déclenchement Ca²⁺ candidats qui se produisent dans un retour sur investissement individuel donné comme suit (étapes 5.5.1-5.5.3) :
   1. Appliquez un filtrage passe-bas à réponse impulsionnelle finie (FIR) de type I sur les séries temporelles ΔF/F à l’aide de l’opération MATLAB fir1 . Réglez la fréquence de coupure sur la valeur de Nyquist (la moitié de la fréquence d’échantillonnage).
   2. Inspectez visuellement la trace filtrée pour confirmer que les pics de trace individuels correspondent à des rafales d’activité Ca²⁺ dans les images 4D enregistrées (Figure 2F).
   3. Identifiez les événements de décharge Ca²⁺ candidats en tant qu’inflexions descendantes concaves dans la trace de la série chronologiqueΔF/F. Définissez un seuil de référence comme la valeur médiane ΔF/F dans les plafonds supérieur et inférieur qui excluent les amplitudes maximale et minimale de 10 % sur toutes les périodes. Définissez un seuil de détection de trois écarts-types au-dessus du seuil de référence (Figure 2F,H).
5. Identifiez les véritables événements de tir Ca²⁺ chez les candidats comme suit (étapes 5.5.1-5.5.2) :
   1. Calculez la pente de chaque événement candidat en dérivant les images de séries temporelles filtrées ΔF/F correspondantes à l’aide de l’opération MATLAB à gradient numérique .
   2. Identifiez ensuite les véritables événements Ca²⁺ en fonction du temps de montée du profil. Définissez un seuil de référence comme la moyenne des valeurs de pente pour tous les événements candidats. Définissez un seuil de détection de trois écarts-types au-dessus du seuil de référence (Figure 2G,H).
6. Caractérisez les événements Ca²⁺ vrais comme suit (étapes 5.6.1-5.6.3) :
   REMARQUE : Ce qui suit n’est pas une liste exhaustive des paramètres qui peuvent être utilisés pour caractériser les événements microgliaux Ca²⁺ . Les paramètres d’intérêt dépendent de l’objectif de l’étude.
   1. Dérivez l’amplitude maximale d’un véritable événement de décharge Ca²⁺ comme la valeur ΔF/F de la trame de série chronologique ΔF/F correspondante.
   2. Dérivez l’amplitude moyenne d’un véritable événement de décharge Ca²⁺ comme la valeur moyenne de ΔF/F sur l’ensemble du sous-ensemble de séries temporelles ΔF/F correspondant.
   3. Dérivez la fréquence des événements Ca²⁺ vrais en divisant le nombre d’événements par le temps d’imagerie.

6. Analyse basée sur les événements

1. Effectuez une analyse basée sur les événements sur les projections z à partir de l’étape 4 à l’aide de la bibliothèque AQuA dans l’environnement de programmation MATLAB. Téléchargez le code à partir de : https://github.com/yu-lab-vt/AQuA.
   REMARQUE : Une procédure pas à pas d’utilisation générale de la bibliothèque AQuA est disponible à l’adresse suivante : https://drive.google.com/file/d/1a3lhe0dUth-5J1-S2fZlPOCZlPbeuvUr/view. La documentation détaillée de la bibliothèque AQuA est disponible à l’adresse suivante : https://drive.google.com/file/d/1CckDLbrkw16b7MPlOQdYpZciIz80Snm_/view.
2. Après avoir lancé MATLAB, passez du dossier de répertoire de travail par défaut au dossier de répertoire de travail désigné par AQuA à l’aide de l’opération cd .
3. Chargez les images 4D enregistrées dans le pipeline d’analyse AQuA comme suit (étapes 6.3.1-6.3.2) :
   1. Lancez l’interface graphique d’AQuA. Saisissez aqua_gui dans la fenêtre de commande MATLAB du dossier de répertoire de travail désigné d’AQuA.
   2. Dans l’interface graphique d’AQuA, cliquez sur nouveau projet et sélectionnez les images enregistrées à analyser. Spécifiez le type de données (GCaMPInVivo_cyto_Lck_) et les paramètres d’imagerie (résolution temporelle secondes par image = 1,993 ; résolution spatiale μm par pixel = 0,25 ; exclure les pixels plus courts que cette distance à la bordure = 5). Cliquez sur Ouvrir pour charger les données.
4. Définissez des points de repère pour les pipelines d’analyse suivants en traçant les zones d’intérêt. Habituellement, les points de repère sont basés sur la limite cellulaire et l’aire du corps cellulaire.
5. Par la suite, détectez les événements candidats Ca²⁺ en exécutant les pipelines d’analyse automatisés pour les paramètres suivants : signal actif, super voxel, détection d’événements, événements propres et événements de fusion.
   REMARQUE : Une explication détaillée de chacun de ces paramètres et de leurs résultats de score candidat est fournie dans la procédure pas à pas AQuA. En bref, ces paramètres ajustent le seuil de détection d’événements Ca²⁺ comme suit : signal actif = amplitude de fluorescence, super voxel = regroupement de fluorescence dans l’espace 3D, détection d’événements = cinétique de montée/décroissance, événements propres = rapport signal/bruit et événements de fusion = séparation temporelle des événements.
6. Inspectez visuellement les événements Ca²⁺ détectés (automatiquement superposés aux images enregistrées d’origine). Si nécessaire, ajustez les paramètres des pipelines d’analyse en tenant compte de la qualité de l’image en fonction des paramètres ci-dessus ; Si la qualité d’image d’un paramètre donné est bonne, un seuil plus élevé peut être défini, et vice versa.
7. Une fois que tous les événements Ca²⁺ ont été détectés de manière appropriée, caractérisez ces événements dans l’environnement MATLAB principal comme suit (étapes 6.8-6.14) :
8. Exportez les fichiers de sortie de l’analyse AQuA.
   REMARQUE : La documentation AQuA fournit une explication détaillée des fichiers de sortie, des entités extraites utilisées pour définir les événements Ca²⁺ et des paramètres sous-jacents de ces entités extraites.
9. (facultatif) Catégorisez tous les événements Ca²⁺ en deux groupes : 1) les événements commençant au soma et 2) les événements commençant au niveau des processus.
10. Accédez à l’amplitude des événements Ca²⁺ individuels dans la structure MATLAB res.dffMat du fichier de sortie d’analyse AQuA (fichier .mat).
11. Dérivez la fréquence des événements Ca²⁺ individuels à l’aide de l’opération MATLAB res.fts.loc.x3D (bibliothèque AQuA).
12. Dérivez la durée des événements Ca²⁺ individuels à l’aide de l’opération MATLAB res.fts.curve.width11 (bibliothèque AQuA).
13. Dérivez l’aire d’événements Ca²⁺ individuels à l’aide de l’opération MATLAB res.fts.basic.area (bibliothèque AQuA).
14. Catégorisez tous les événements Ca²⁺ comme suit : 1) événements locaux, 2) événements de propagation voyageant vers le soma et 3) événements de propagation s’éloignant du soma. Pour ce faire, utilisez les opérations MATLAB res.fts.region.landmarkDir.chgToward et res.fts.region.landmarkDir.chgAway (bibliothèque AQuA) (Figure 3C).

Résultats

Chez les souris transgéniques exprimant exclusivement GCaMP6 (protéine fluorescente sensible au Ca²⁺) dans la microglie, nous observons généralement divers modèles d’activité microgliale du Ca²⁺ (Figure 2A). Il est important de noter que même au sein d’une seule microglie, les modèles d’activité de Ca²⁺ peuvent différer considérablement entre les processus.

Pour quantifier de telles différences de processus à processus dans la dynamique spatio-temporelle de l’activité microgliale Ca²⁺, les zones stables doivent d’abord être identifiées, puis divisées en ROI finement segmentés (Figure 2B,C). Pour chaque ROI, des paramètres d’activité Ca²⁺ doivent être dérivés et quantifiés, tels que l’amplitude et la fréquence, en extrayant des caractéristiques telles que les amplitudes locales et les pentes de traces de la série temporelle d’intensité de fluorescence (Figure 2D-G).

Ensuite, les événements individuels Ca²⁺ doivent être examinés en appliquant l’algorithme de quantification précis AQuA (Figure 3A). À partir de ces analyses basées sur les événements, de grandes différences sont généralement observées dans l’origine, l’amplitude, la durée, l’emplacement et les caractéristiques de direction d’écoulement des événements Ca²⁺ individuels (Figure 3B). Si l’on se concentre sur l’analyse de la dynamique de l’activité de Ca²⁺ dans les processus microgliaux, un schéma de classification des événements locaux, des événements se déplaçant vers le soma et des événements s’éloignant du soma est informatif (Figure 3C).

Figure 1 : Dispositif expérimental d’imagerie microgliale Ca²⁺ in vivo. (A) Dispositif expérimental. Une souris Iba1-tTA × tetO-GCaMP6 avec expression de GCaMP6 spécifique à la microglie. En insérant une fenêtre crânienne dans le crâne de la souris, l’activité microgliale Ca²⁺ peut être observée in vivo à l’aide de la microscopie à deux photons. (B) Calendrier expérimental et procédure d’analyse. Les images 4D sont acquises pendant au moins 10 minutes sous forme de piles Z de cinq images. Le taux d’acquisition d’images est de 2,5 images/s. Avant d’analyser l’activité microgliale de Ca²⁺, les empilements z à cinq images sont convertis en projections z 2D en prenant l’intensité moyenne (ou maximale). La vitesse de lecture de la projection z est de 0,5 image/s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse basée sur le retour sur investissement de l’activité microgliale Ca²⁺. (A) Projection d’intensité moyenne de GCaMP6 sur 10 min pour une microglie individuelle. (B) Les zones stables (en blanc) sont définies par une superposition de projections t binarisées d’intensité maximale de GCaMP6 dérivées d’échantillons de 2 minutes prélevés au début (magenta) et à la fin (en vert) d’une période d’imagerie. (C) Les zones stables sont davantage segmentées en ROI régionaux. Les couleurs individuelles indiquent les retours sur investissement individuels. (D) Traces ΔF/F de tous les retours sur investissement individuels en C. Notez la variation des modèles d’activité entre les retours sur investissement. (E) Trace originale d’une série chronologique ΔF/F dérivée des valeurs d’intensité absolues pour un seul ROI. (F) La même série chronologique ΔF/F après filtrage passe-bas. Les événements candidats Ca²⁺ sont détectés par un seuil de coupure d’amplitude (ligne rouge) défini comme la ligne de base + trois écarts-types. La ligne de référence (ligne verte) est définie comme la valeur médiane de l’ensemble de la série chronologique ΔF/F à l’intérieur d’un plafond supérieur et inférieur qui exclut les valeurs maximales et minimales de 10 % des valeurs ΔF/F. (G) La trace de pente dérivée de la série temporelle filtrée ΔF/F en F. Les événements Ca²⁺ vrais sont triés à partir des événements Ca²⁺ candidats en fonction d’un seuil de coupure de pente (ligne rouge) défini comme référence + trois écarts-types. La ligne de référence (ligne verte) est définie comme la valeur moyenne sur l’ensemble de la série chronologique de pente à l’intérieur d’un plafond supérieur et inférieur qui exclut les valeurs maximales et minimales de 10 % des valeurs de pente. (H) Les événements candidats Ca²⁺ identifiés par des critères d’amplitude en F sont indiqués en orange. Véritables épreuves Ca²⁺ classées à partir des épreuves candidates Ca²⁺ par critères de pente en G en rouge. Notez que certaines épreuves candidates de Ca²⁺ ont été fusionnées sur la base des critères de pente. Les séries chronologiques filtrées ΔF/F correspondantes sont superposées ci-dessous à titre de référence. La ligne noire indique une amplitude nulle (ΔF/F). L’amplitude moyenne et maximale des événements Ca²⁺ vrais est dérivée comme la moyenne et le maximum de leurs pics correspondants dans la série chronologique filtrée ΔF/F. La fréquence (événements/min) est calculée en divisant le nombre d’événements de décharge Ca²⁺ réels par la période d’imagerie (10 min). Barres d’échelle = 20 μm (A,B), 10 μm (C). Abréviation : ROI = région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse basée sur les événements pour l’activité microgliale Ca²⁺. (A) Images représentatives des événements détectés à l’aide de l’algorithme AQuA. Les couleurs indiquent les zones d’événements individuelles détectées à un moment donné. (B) Activité Ca²⁺ normalisée représentative (ΔF/F) dans les événements individuels triés par ordre d’apparition. La barre de droite indique la couleur ΔF/F. (C) Empreintes d’activité représentatives des événements se propageant vers et loin du soma ou des événements locaux. Pour les événements locaux, la forme de l’événement est indiquée en bleu. Pour les événements de multiplication, l’heure d’apparition de l’événement est indiquée par une échelle bleu-jaune. Étant donné que l’AQuA détecte initialement les événements Ca²⁺ individuellement, les événements de propagation sont identifiés par la suite en fonction des emplacements spatiaux qui se chevauchent et des séries chronologiques de plusieurs événements individuels Ca²⁺. Notez qu’il s’agit de la même branche dendritique utilisée pour l’analyse du retour sur investissement dans la figure 2E-H. Barres d’échelle = 20 μm (A), 10 μm (C). Abréviation : ROI = région d’intérêt ; S = soma. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cet article présente une approche améliorée pour l’imagerie de l’activité microgliale Ca²⁺ avec une résolution spatio-temporelle élevée. Cette méthode est suffisamment sensible pour détecter différents types d’activité microgliale Ca²⁺ au niveau des processus ramifiés uniques, en distinguant facilement les événements locaux et les événements de propagation.

Dans la méthode générale d’imagerie à deux photons in vivo de l’activité microgliale Ca²⁺ , une attention particulière doit être portée aux points suivants pour maximiser la qualité de l’imagerie. Tout d’abord, comme les microglies sont extrêmement sensibles aux blessures, il est important de minimiser le contact direct avec la surface du cerveau avec des outils chirurgicaux pendant la chirurgie. Les principales indications que la chirurgie a été pratiquée avec compétence sont des vaisseaux sanguins et une dure-mère intacts et des saignements très minimes pendant la chirurgie. Deuxièmement, la fixation sécurisée de la plaque frontale au crâne de la souris et un bon contact entre la double lamelle et la surface du cerveau réduisent considérablement les artefacts liés au mouvement pendant l’imagerie. Ceci est particulièrement important lors de l’imagerie avec des résolutions spatio-temporelles élevées et chez des souris complètement éveillées. Alors que le pipeline d’analyse compense de manière fiable les artefacts liés au mouvement résultant du rythme cardiaque, de la respiration et de la dérive générale, il est moins robuste lorsqu’il s’agit de gérer des distorsions géométriques importantes résultant de mouvements brusques et importants.

Les deux méthodes d’analyse décrites ici offrent des avantages différents et sont adaptées à des questions de recherche différentes. Dans l’analyse basée sur le ROI, l’utilisateur prédéfinit le ROI (comme les processus individuels), ce qui permet d’extraire la dynamique agrégée de l’activité Ca²⁺ de ce ROI. Ainsi, il est le plus adapté aux situations où l’on s’attend à ce que les phénomènes soient localisés dans une zone subcellulaire qui a à la fois des limites morphologiques bien définies et une zone relativement grande (c’est-à-dire une branche de processus). Dans l’analyse basée sur les événements, les événements individuels sont définis en fonction de la dynamique spatio-temporelle de l’activité microgliale Ca²⁺ elle-même et doivent ensuite être placés dans le contexte de points de repère définis par l’utilisateur au sein de la microglie pour que leur fonction soit interprétée. Ainsi, il est le plus adapté aux situations où des hypothèses sur la localisation des phénomènes ne peuvent pas être faites ou lorsque la zone d’intérêt est relativement petite (c’est-à-dire une pointe de processus). En tant que telle, l’analyse basée sur les événements offre une meilleure résolution spatio-temporelle lors de la caractérisation de l’activité microgliale Ca²⁺ par rapport aux méthodes précédentes.

Chez ces souris, le seul marqueur fluorescent exprimé par la microglie est l’indicateur Ca²⁺ GCaMP6. Ainsi, dans les régions où l’activité de Ca²⁺ est faible, la morphologie microgliale doit être extraite en combinant plusieurs cadres temporels, ce qui peut dégrader la résolution temporelle. Cependant, cette limitation peut être surmontée en exprimant une protéine rouge distincte à fluorescence stable dans la microglie. Notamment, de nouveaux virus adéno-associés capables de transfecter la microglie ont récemment été décrits 23,24,25.

La façon dont l’activité microgliale Ca²⁺ est modifiée par l’environnement environnant est un sujet d’intérêt émergent. En particulier, l’activité microgliale Ca²⁺ semble montrer des corrélations significatives avec l’activité neuronale, bien que la signification fonctionnelle de celle-ci n’ait pas encore été complètement caractérisée. Ainsi, la combinaison de la manipulation de l’activité neuronale avec les méthodes d’imagerie et d’analyse de l’activité microgliale Ca²⁺ présentées ici devrait apporter de nouvelles connaissances sur la physiologie microgliale et faire progresser notre compréhension des rôles que jouent les microglies dans les états physiologiques et pathologiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% xylocaine jelly	AstraZeneca, UK
B6(129S6)-Tg(Aif1-tTA)54Kftnk	RIKEN RBC, Japan	RBRC05769	Iba1-tTA mice
B6;129-Actb(tm3.1(tetO-GCaMP6)Kftnk)	RIKEN RBC, Japan	RBRC09552	tetO-GCaMP6 mice
Forceps	Fine science tools, US	13008-12
G-CEM ONE	GC corporation, Japan
Glass capillary	Narishige, Japan	GDC-1
ImageJ	NIH, US
Isofulrane	Pfizer, US
Ketamin	Daiichi-Sankyo, Japan
Kwik-sil	World Precision Instruments, US	KWIK-SIL
MATLAB, 2020a	MathWorks, US
Micro cover glass  (2 x 2 mm, No.3)	Matsunami, Japan	custum-made	Bottom glass for cranial  window
Micro cover glass  (3 x 3 mm, No.0)	Matsunami, Japan	custum-made	Upper glass for cranial window
N25X-APO-MP	Nikon, Japan	N25X-APO-MP	Objective lens (25x)
Norland optical adhesive	Edmund optics, US	6101
Piezo nano-positioning system, Nano-Drive	Mao City Labs, US
Razor blade	Feather, Japan	FA-10
Scissors	Fine science tools, US	14060-11
Steel drill	Minitor, Japan	BS1201
Stereotaxic instruments	Narishige, Japan	SR-5M-HT
Super-bond (C&B kit)	Sun Medical, Japan	4560227797382
Surgical needle hook	Fine science tools, US	10065-15
Ti:Sappire laser, MaiTai DeepSee	Spectra Physics, US	Mai Tai eHP DS
Tweezers	Fine science tools, US	11051-10
Tweezers	Fine science tools, US	11255-20
Two-photon microscope	Nikon, Japan	A1R-MP
UV craft resin	Kiyohara, Japan	UVR
Xylazine	Bayer, Germany