Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council et la Fondation Marie-Curie internationales de réintégration PAT (à JKV).

1. Cueillette de clones d&#39;expression d&#39;ADNc <ol><li> La banque d&#39;ADNc est fourni en simples clones bactériens dans les stocks de glycérol dans un format 96-puits. Utilisation de la commande Rearray dans le menu du sélecteur de la CP7200 Norgen, choisissez clones bactériens de la plaque de source et inoculer dans 1,5 ml de LB / amp dans un 96-puits profonds (1 ml bien) plaque. </li><li> Sceller les plaques Deepwell avec un joint perméable au gaz et incuber une nuit à 37 ° C dans un shaker. </li></ol> 2. Préparation de la banque d&#39;expression d&#39;ADNc <ol><li> Faites tourner les plaques Deepwell contenant les bactéries à 2.000 tours par minute pendant 20 minutes en utilisant des adaptateurs plaque dans une centrifugeuse de table. </li><li> Aspirer le support du puits, en laissant intact le culot bactérien. </li><li> Configurer le pont de la station de travail d&#39;automatisation de laboratoire comme le montre la figure 2. Solutions pour la préparation de plasmide sont réparties dans des auges 1-5 et la plaque Deepwell est placé sur la plate-forme. Un creux à cavités multiples avec une solution d&#39;élutionest placé à côté de la plaque Deepwell. Conseils sont chargés dans les portoirs de pointes. </li><li> Assembler le collecteur à vide. La plaque de fixation plasmide est placé à l&#39;intérieur du collecteur et la plaque de filtre plasmide est placé au-dessus du collecteur. </li><li> Resuspendre boulettes avec 250 ul de solution 1 (tampon de remise en suspension) par pipetage de haut en bas. </li><li> Lyser les bactéries par addition de 250 ul Solution 2 (tampon de lyse). La plaque est rendue étanche et inversée pour permettre un mélange complet. </li><li> Start 2 min minuterie. </li><li> Ajouter 350 ul Solution 3 (tampon de neutralisation). Sceller la plaque et retourner 3 fois. </li><li> Transfert des lysats bactériens aux plaques plasmide filtre. </li><li> Appliquer une dépression pendant 5 min. </li><li> Retirer la plaque du filtre et placez la plaque de fixation sur le dessus de la rampe. Appliquer une dépression pendant 1 min. </li><li> Ajouter 500 ul de lavage supplémentaire (AW) tampon. </li><li> Appliquer une dépression pendant 2 min. </li><li> Ajouter 900 ul de la solution tampon de lavage 4. Appliquer une dépression pendant 2 min. </li><li> Répétez step 2.14. Appliquer une dépression de 15 minutes supplémentaires. </li><li> Placez la plaque de prélèvement d&#39;ADN à l&#39;intérieur du collecteur. Ajouter 100 ul de tampon d&#39;élution à la plaque de fixation et incuber pendant 2 min. </li><li> Sous vide pendant 10 min. </li><li> Retirer la plaque de la collecte et de la concentration d&#39;ADN mesure en utilisant le 8000 Nanodrop. Typiquement un rendement de ~ 100 ng / ul on peut s&#39;attendre avec cette méthode. </li></ol> 3. L&#39;ensemencement de cellules <ol><li> Les cellules HEK293 sont trypsinisées et comptées. </li><li> 2 x 10 4 cellules sont distribués dans chaque puits d&#39;une Viewplate PerkinElmer en utilisant le ThermoFisher de 96 puits multipoint. </li><li> Les cellules sont incubées une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol><li> Préparer un mélange de 100 ng GFP-Grb2 ADN plasmidique avec 100 ng d&#39;ADNc dans 25 pl de milieu sans sérum par puits dans un fond rond de 96 puits. </li><li> Ajouter 25 ul de milieu sans sérum contenant 0,5 Transfectin ul par puits. </li><li> Mélanger et démarrer la minuterie for 30 min. </li><li> Transférer 50 ul d&#39;ADNc / Transfectin mélange aux cellules en utilisant une méthode douce de distribution. Alternativement, le mélange de transfection peuvent être dispensés d&#39;abord en plaques et les cellules ajoutées sur le dessus (transfection inverse). </li><li> Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 5. Image Acquisition <ol><li> Lancez le logiciel Opera. Une capture d&#39;écran du montage expérimental est illustré à la figure 3. Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Configuration&quot; et sélectionnez objectif 20x et le type de plaque correct. Veiller à &quot;col&quot; est réglé sur la valeur correcte sur l&#39;objectif de permettre de se concentrer avec différents types de plaques. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;Microscope&quot; onglet. Définir l&#39;exposition 1 comme FITC (488 laser) et de l&#39;exposition 2 comme UV (365 laser). Activez le filtre anti-UV sur les deux expositions et d&#39;affecter l&#39;exposition 1 à la caméra 1 et 2 à l&#39;exposition caméra 2. Réglez le temps d&#39;exposition à 800 msec pour une exposition de 1 à 40 ms pour l&#39;exposition 2. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;Microscope&quot; onglet. Définir exposition 1 comme FITC (488 laser) et de l&#39;exposition 2 comme UV (365 laser). Activez le filtre anti-UV sur les deux expositions et d&#39;affecter l&#39;exposition 1 à la caméra 1 et 2 à l&#39;exposition caméra 2. Réglez le temps d&#39;exposition à 800 msec pour une exposition de 1 à 40 ms pour l&#39;exposition 2. </li><li> Sélectionnez exposition 1. Réglez la hauteur concentrer à 0 um. Sélectionnez &quot;Mise au point&quot;. Une fois la mise, exposer l&#39;appareil photo 1. Réglez la hauteur du foyer afin d&#39;optimiser le plan d&#39;exposition et cliquez sur &quot;Take hauteur&quot;. Modifiez les durées d&#39;exposition et la puissance laser pour donner une intensité de pixel maximum de ~ 3.000. Enregistrer les paramètres d&#39;exposition. Répétez l&#39;opération pour l&#39;exposition 2. </li><li> Sélectionnez &quot;Définition Experiment&quot; onglet. Créez mise en page et sublayout. Glissez et déposez la disposition pertinente, l&#39;exposition, l&#39;image de référence skewcrop fichier et sublayout. Enregistrer expérience. </li><li> Sélectionnez &quot;Expérience automatique&quot; onglet et acquérir des images. </li></ol> 6. Image Analysis (Basé sur ImageJ 1.46h version.) <ol><li> Convertir le PerkinElmer propriétaire. Fichiers flex au format Tagged Image. Tif en utilisant leFlex2Volocity Acapella script. </li><li><ol><li> Importer des images dans ImageJ comme une séquence d&#39;images, ce qui entraîne une erreur. </li><li> Convertir la pile dans un HyperStack 2 canaux en sélectionnant l&#39;image / HyperStack / Pile à option de menu HyperStack. Le nombre de tranches doit être réglé à la moitié de la pile importés. </li><li> Dupliquer le canal de la GFP en utilisant l&#39;éditeur / commande Dupliquer: cochez la case en double HyperStack et choix des canaux: 1-1. Ci-après utilisent la pile en double. </li></ol></li><li> Sélectionnez Process / Améliorer contraste avec 0,01% de pixels saturés, utilisant un histogramme de la pile et le convertir en 8 bits avec Image/Type/8-bit. </li><li> Définir un rayon de 15 pixels segmentation locale adaptative en utilisant l&#39;algorithme Bernsen avec seuil de contraste (paramètre 1) q = 30. Cochez les objets blancs sur fond noir case à cocher dans le menu Image / Adjust / Seuil automatique locale. </li><li> Contrôle de la qualité de la segmentation: segmentation générer superposition contour de l&#39;objet sur les images originales. </li><li> Feature d&#39;extraction par analyse de particules: zone de mesure, la moyenne et l&#39;intensité totale de chaque organite. Enregistrer les fichiers de résultats. </li><li> Ouvrez le fichier résultat fonctionnalités de R et de générer un histogramme. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Dans des conditions normales de Grb2 est localisée tout au long de la totalité de la cellule. Lors de la stimulation d&#39;un récepteur du facteur de croissance, il translocation vers la membrane plasmique et est ensuite internalisée dans les endosomes, comme indiqué dans la figure 4. L&#39;expression d&#39;un récepteur de surface cellulaire capable de Grb2 liaison est suffisante pour induire cette translocation. Dans une expérience typique de dépistage, aucun changement dans la GFP-Grb2 localisation est observée. Cependant, quand une protéine est exprimée que Grb2 recrues vers un site sub-cellulaire, il ya un changement dans la localisation qui peuvent être facilement visualisées par microscopie à fluorescence. Par exemple, l&#39;expression de l&#39;EGFR dans les résultats relocalisation de la GFP-Grb2 à endosome structures semblables (Figure4). Ainsi, en appliquant une bibliothèque échelle du génome, on peut s&#39;attendre à ce que de nouveaux Grb2 protéines de liaison à la surface cellulaire peuvent être identifiés. Cette méthode n&#39;est pas limitée à la détection de protéines de surface cellulaire. Par exemple, Dynamin2 induit un changement de localisation sub-cellulaire de la GFP-Grb2 affichage endosome comme le recrutement (figure 5). Dynamin2 se lie au domaine SH3 C-terminal de la protéine Grb2 et est impliqué dans l&#39;endocytose de ce complexe 9,10. Ainsi, cette approche permet l&#39;identification des complexes protéiques générales contraignantes et ne se limite pas à l&#39;identification de partenaires d&#39;interaction pour le domaine SH2. Plusieurs types de translocation peut s&#39;attendre comme la localisation de la membrane plasmique, vers les endosomes, d&#39;autres structures vésiculaires cytoplasmiques ou vers le noyau. Par conséquent, il est recommandé que toutes les images sont également inspectés à l&#39;oeil. Toutefois, lorsque le dépistage de grands ensembles d&#39;ADNc un système automatiséalgorithme d&#39;analyse d&#39;image est plus pratique. Dans ce cas, une combinaison d&#39;algorithmes est souhaitable, comme la détection tache d&#39;identifier les endosomes, le cytoplasme / noyau de détection pour identifier nucléaires navette et générale algorithmes morphologiques pour identifier les changements de forme cellulaire. L&#39;utilisation de ces différentes méthodes de détection phénotypique a été examinée plus en détail dans d&#39;autres 11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme d&#39;ensemble de l&#39;expérience. L&#39;expérience détails d&#39;un flux de travail de dépistage complet à haute teneur en commençant par l&#39;amplification et la préparation de la banque d&#39;ADNc, la transfection de vecteurs d&#39;ADNc ainsi que des constructions rapporteurs, l&#39;acquisition d&#39;images et l&#39;analyse d&#39;images à l&#39;aide du logiciel gratuit open ImageJ. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Faigure 2. Configuration de la plate-forme Tecan. (1) Sur le côté gauche, cinq bacs 100 ml doivent être remplis avec des tampons 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) et A4 (100 ml). A4 fosse devra être rempli une fois au cours de la procédure. (2) Le collecteur à vide se trouve sur la position 14 dans cet exemple. (3) La plaque Deepwell avec culots bactériens se trouve sur la position 30, à côté de la cuve tampon d&#39;élution avec 25 ml de tampon d&#39;élution. (4) embouts jetables pour la tête 8-canaux doivent être chargés dans les portoirs de pointes sur le côté gauche et des conseils pour la tête multicanal doivent être remplis sur la position 40. Le gestionnaire de Tecan liquide FreedomEvo qui est utilisé dans cette expérience est équipé de 500 seringues ul. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Figure3. L&#39;automatisation de l&#39;acquisition d&#39;images sur le LX Opéra. A) Sélectionnez l&#39;onglet Configuration (1). Activer les lignes laser nécessaires pour l&#39;expérience (2). Sélectionnez les caméras d&#39;acquisition d&#39;images (3). Sélectionnez le type de plaque et objectif de l&#39;expérience (4). B) Sélectionnez l&#39;onglet microscope (1). Définir la source de lumière et du temps d&#39;exposition pour l&#39;exposition 1 (2,3). Focus sur un bien et prendre de la hauteur (4). C) Sélectionnez l&#39;onglet Définition expérience (1). Glissez et déposez l&#39;exposition, skewcrop, de référence, mise en page et fichiers sublayout (2). Glissez-déposez le fichier d&#39;expérience (3). D) Sélectionnez expérience Automatique (1). Faites glisser et déposez le fichier expérience (2). Allouer des codes à barres approprié (3). Démarrer l&#39;acquisition d&#39;images en cliquant sur ​​le bouton de démarrage (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Figure 4. GFP-Grb2 translocation par l&#39;expression d&#39;ADNc. GFP-Grb2 déménage d&#39;une localisation prédominante cytoplasmique endosome structures semblables à la surexpression d&#39;un récepteur du facteur de croissance transmembranaire et intériorise la suite vers les endosomes. Sur la gauche, des images de microscopie de COS M6 cellules sont présentés qui ont été transfectées de façon transitoire avec GFP-Grb2 (en haut) ou GFP-Grb2, plus EGFR (en bas). La co-expression de l&#39;EGFR dans les résultats relocalisation de la GFP-Grb2 à endosome structures semblables. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Figure 5. Exemple d&#39;ADNc induit la translocation de la GFP-Grb2. Le Dynamin2 GTPase, qui est impliqué dans l&#39;endocytose Grb2, déménage GFP-Grb2 à endosome structures semblables (dans le cercle). Dans cette expérience, la GFP-Grb2 a été co-transfectées avec DNM2 dans les cellules HEK293T. Les cellules ont été colorées avec Hoechst 33342 après 24 h et images ont été acquises sur le Opera LX. Un champ de vision de la verte (GFP) et le canal UV (bleu, Hoechst 33342) est affiché.

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	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Clonage d&#39;expression est un puissant outil qui a été utilisé dans le passé pour identifier de nouveaux composants cellulaires tels que les récepteurs du virus et les antigènes des globules 12. Nous décrivons ici une méthode pour faciliter l&#39;identification de nouveaux récepteurs putatifs de transduction du signal qui se lient à la protéine Grb2. Il ya quelques étapes critiques dans le protocole. <ol><li> Pour la préparation de plasmide automatisé, il est absolument essentiel d&#39;avoir remise en suspension complète du culot bactérien. Parfois, il est nécessaire d&#39;inclure une étape rigoureuse secouant ou en mélange supplémentaire avec des pipettes. </li><li> Lors de l&#39;addition de la solution 2 et 3, le mélange complet est essentiel et nous avons trouvé que manuellement inversant la plaque scellée est plus efficace que l&#39;utilisation d&#39;un agitateur automatisé. Pipetage devrait être évité à cette étape car elle conduirait à un cisaillement de l&#39;ADN. </li><li> Dans toutes les étapes de vide, il faut veiller à ce que le liquide soit complètement vidéà partir de la plaque. Sinon rendements faibles sont à prévoir. </li><li> Après élution, il est assez fréquent que éluat gouttes se forment au bas de la plaque de plasmide contraignant. Ces baisses doivent être collectées dans la plaque d&#39;élution, il est donc recommandé que la plaque de plasmide liaison est soulevée avec précaution et les gouttes résiduelles au fond sont soigneusement transférés à la plaque éluat. </li><li> Au cours de la transfection, le temps de formation du complexe est critique. Nous adhèrent généralement à 20-30 min. Des temps plus longs jusqu&#39;à 1 h sont très bien sans baisse de rendement, tandis que des temps plus courts ne sont pas recommandés. </li><li> Pour la microscopie, le choix du grossissement est important. Sur le système Opera LX utilisée ici, la résolution à 20x est suffisant pour obtenir des images de haute qualité. Si des images haute résolution sont nécessaires, l&#39;objectif peut être changé, mais dans le but d&#39;obtenir des chiffres statistiquement significatifs de cellules, un plus grand nombre de domaines et les temps d&#39;acquisition plus élevés sont nécessaires. En général, nous visonsd&#39;obtenir au moins 100 cellules par puits imagés. </li></ol> Le test de translocation Grb2 a été utilisé par d&#39;autres groupes pour identifier les petites molécules inhibitrices de l&#39;EGFR kinase d&#39;activation 6. Dans ce cas, l&#39;EGFR est spécifiquement activé par un ligand provoquant le recrutement de Grb2 à la membrane plasmique. La perturbation de cette interaction peut alors être étudiée en utilisant des composés à petites molécules. De même, il peut être envisagé que les écrans siRNA peuvent être utilisées pour identifier les gènes endogènes impliquées dans la signalisation EGFR-Grb2 ou d&#39;autres Grb2-récepteurs de liaison du facteur de croissance tels que c-KIT ou le récepteur de l&#39;érythropoïétine. Ainsi, il existe de multiples applications potentielles de cette technique. Une approche analogue peut être appliquée aux systèmes rapporteur GFP-marqués pour d&#39;autres molécules adaptatrices comme Shc, Gab ou IRS. Un avantage majeur de l&#39;utilisation de ce dosage à base de cellules dans les cellules de mammifères est qu&#39;elle permet d&#39;identifier physiologiquement relinteractions Evant. Le dosage est une lecture pour la formation des protéines complexes, mais plus important encore, les interactions pertinentes sont suivies à la bonne sub-cellulaire site. À cet égard, cette technique permet de surmonter les artefacts provenant d&#39;autres méthodes d&#39;interaction protéine-protéine tels que la levure double hybride ou in vitro. Il est à noter cependant, que les interactions indirectes peuvent également entraîner le recrutement de Grb2. De même, la transcription régulation à la hausse de partenaires de liaison peut être induite par l&#39;expression d&#39;ADNc. Pour faire la distinction entre ces deux possibilités, il est nécessaire d&#39;effectuer les dosages appropriés secondaires de distinguer entre les effets directs et indirects de liaison. En conclusion, le dosage de la GFP adaptateur molécule translocation promet un fort potentiel pour l&#39;ensemble du génome de dépistage et de découverte de médicaments.

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> banque d&#39;ADNc </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perméables aux gaz joints </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 Kit plasmide </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Liberté Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Avec rampe à vide </td></tr><tr><td> 384 Multidrop </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opéra LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Transduction du signal par les récepteurs du facteur de croissance est essentielle pour les cellules pour maintenir prolifération et la différenciation et exige un contrôle strict. Transduction du signal est initiée par la liaison d&#39;un ligand externe à un récepteur transmembranaire et l&#39;activation des cascades de signalisation en aval. Un régulateur clé de la signalisation mitogénique est Grb2, une protéine modulaire composé d&#39;un interne SH2 (Src homology 2) de domaine flanqué de deux domaines SH3 qui manque de l&#39;activité enzymatique. Grb2 est constitutivement associé à la GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) par l&#39;intermédiaire de son extrémité N-terminale du domaine SH3. Le domaine SH2 de Grb2 se lie aux récepteurs de facteurs de croissance à résidus tyrosine phosphorylés donc d&#39;accouplement à l&#39;activation du récepteur de la cascade SOS-Ras-MAP-kinase de signalisation. En outre, d&#39;autres rôles pour Grb2 comme un régulateur positif ou négatif de la signalisation et de l&#39;endocytose des récepteurs ont été décrits. La composition modulaire de Grb2 suggère qu&#39;il peut s&#39;arrimer à une variété de récepteurs et TRANSDUCe signale le long d&#39;une multitude de différentes voies 1-3. Décrite ici est un test simple qui surveille la microscopie recrutement de Grb2 à la membrane plasmique. Il est adapté à partir d&#39;un dosage qui mesure les changements de localisation sub-cellulaire de la protéine fluorescente verte (GFP)-tag Grb2 en réponse à un stimulus 4-6. Récepteurs membranaires plasmatiques qui lient Grb2 comme récepteur activé par le facteur de croissance épidermique (EGFR) recruter GFP-Grb2 à la membrane plasmique lors de l&#39;expression d&#39;ADNc et ensuite déménager à endosomes dans la cellule. Afin d&#39;identifier de complexes protéiques in vivo de la protéine Grb2, cette technique peut être utilisée pour effectuer un génome à haut contenu de l&#39;écran en fonction de l&#39;évolution de Grb2 localisation sub-cellulaire. La préparation de clones d&#39;expression d&#39;ADNc, la transfection et l&#39;acquisition d&#39;images sont décrites en détail ci-dessous. Comparé à d&#39;autres méthodes génomiques utilisés pour identifier les partenaires d&#39;interaction de protéines, comme la levure-deux-hybrid, cette technique permet la visualisation des complexes de protéines dans les cellules de mammifères sur le site sub-cellulaire de l&#39;interaction par un simple microscopique de dosage. D&#39;où les deux caractéristiques qualitatives, comme les schémas de localisation peut être évaluée, ainsi que la force quantitative de l&#39;interaction.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Procédé de criblage à haut contenu de la nouvelle identification de signalisation des récepteurs transmembranaires compétentes est décrite. Cette méthode se prête à l&#39;automatisation à grande échelle et permet des prédictions sur<em&gt; In vivo</em&gt; La liaison aux protéines et la localisation sub-cellulaire des complexes de protéines dans les cellules de mammifères.

Un workflow d&#39;imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d&#39;expression

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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10.5K vues.  University College London. Procédé de criblage à haut contenu de la nouvelle identification de signalisation des récepteurs transmembranaires compétentes est décrite. Cette méthode se prête à l'automatisation à grande échelle et permet des prédictions sur In vivo La liaison aux protéines et la localisation sub-cellulaire des complexes de protéines dans les cellules de mammifères.

Vidéo: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

L&#39;analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...