This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthèse Remarque: dfTAT est construit en deux étapes: synthèse du monomère de fTAT par synthèse peptidique en phase solide suivie d&#39;une dimérisation de liaison disulfure pour former dfTAT. <ol><li> Swell 500 mg de Rink Amide MBHA dans le diméthylformamide (DMF) dans un 50 ml navire SPPS standard pour 1 h. </li><li> Effectuer Fmoc déprotection par incubation de la résine Fmoc protégé dans une solution de pipéridine à 20% (20% de pipéridine dans du DMF, 10 ml (0,30 mmol). Effectuer les étapes de déprotection de deux fois (1 x 5 min et 1 x 15 min) avec une étape de lavage à l&#39;aide DMF (l&#39;étape de lavage comprend le rinçage de la résine plusieurs fois avec un volume total d&#39;environ 150 ml de DMF et l&#39;élimination du solvant par filtration sous vide) entre les deux réactions. </li><li> Synthétiser CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sur la résine MBHA patinoire amide. Utilisation suivant la acides aminés protégés par Fmoc: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (uniquement sur les N-terminale), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys et (Trt) -OH. Réaliser la réaction en utilisant N 2 (20 PSI) à agiter la réaction. Effectuer toutes les réactions à la température ambiante. <ol><li> Effectuer chaque acide réaction de couplage aminé pendant 4 heures. Pour chaque couplage, utiliser la protection Fmoc acide aminé (1,2 mmol), de N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyl- O- (benzotriazol-1 H 1-yl) uronium (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmoles ), et de la diisopropyléthylamine (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) dissous dans du DMF. Après le couplage de 4 heures, laver la résine avec du DMF et d&#39;effectuer l&#39;étape de déprotection Fmoc comme décrit dans l&#39;étape 1.2. </li><li> Répéter jusqu&#39;à ce que la chaîne peptidique linéaire de fTAT (chaîne peptidique linéaire: CKRKKRRQRRRG aucun TMR) a été synthétisé. </li><li> Puis, lavez soigneusement la résine en utilisant d&#39;abord et après que le DMF avec du dichlorométhane (DCM). Rincer la résine plusieurs fois avec un volume total d&#39;environ 150 ml de DMF ou le DCM et éliminer le solvant par filtration sous vide. </li><li> Use MALDI-TOF afin de confirmer que le peptide obtenu a la masse moléculaire correcte. <ol><li> Ajouter un mélange de matrice par addition de 1 mg de la matrice à une solution composée de 50 ul de TFA à 0,01% d&#39;eau et de solution 50 ul d&#39;acétonitrile. </li><li> Pour confirmer linéaire de masse de la chaîne peptidique, l&#39;acide α-utiliser cyano-4-hydroxycinnamique. Exécuter une HPLC analytique du peptide brut et recueillir 50 pi du sommet du pic pur. </li><li> Pour préparer l&#39;échantillon à la plaque sur la plaque MALDI: Ajouter 8 pi de peptide à 2 pi de la solution de matrice et les placer sur la plaque MALDI sécher à l&#39;air ou sur une plaque de 37 ° C de chaleur. Note: L&#39;arginine est connue pour être difficile à un acide couple dans SPPS aminés. Couplage succès est établi en effectuant un test de Kaiser 14 (test par exemple, la ninhydrine). Cet essai permet la détection d&#39;amines libres qui pourraient subsister désaccouplé sur la résine. Dans le cas où une couleur bleue est détectée (indicatif de la présence d&#39;amines libres), le couplage sPTE sont répétées. </li></ol></li></ol></li><li> Pour CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), cliver le groupe protecteur Mtt au groupe a-amino de Lys sur CK (-NH-MTT) TATG avec une solution composée de 1% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) et 2% de triisopropylsilane (TIS) dans le DCM. <ol><li> Comme l&#39;élimination de groupe protecteur MTT se traduirait par l&#39;apparition d&#39;une couleur jaune, incuber la résine avec 20 ml de la solution ci-dessus pendant 5 min, jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne répéter cette couleur jaune est observée. Laver la résine avec du DCM et du DMF dans l&#39;intervalle. En outre, depuis TIS est un charognard qui piéger le MTT, une fois pas de couleur jaune apparaît dans la solution en présence de MTT. </li><li> Ajouter une solution supplémentaire de 1% de TFA dans du DCM (pas d&#39;TIS) pour la résine destinée à assurer qu&#39;aucune plus MTT est éliminée et la solution reste limpide. </li></ol></li><li> Dissoudre les trois composantes: carboxytétraméthylrhodamine (TMR), HBTU et de DIEA (4, 3,9 et 10 l&#39;équivalence en ce qui concerne la quantité de résine (en mg)) dans le DMF et ajouter ce mélangeà la résine et effectuer la réaction O / N à l&#39;aide de N2 sec à fournir une agitation. </li><li> Après Fmoc-déprotection et la conjugaison d&#39;acides aminés, laver la résine avec du DCM et laisser sécher. Pour le clivage complet du peptide de la résine, ajouter une solution contenant 92,5% de TFA, 2,5% de H 2 O, 2,5%, TIS, et 2,5% d&#39;éthanedithiol (EDT) (volume total = 4 ml) à la peptidyl-résine pour trois heure à température ambiante pour obtenir une déprotection globale et le clivage de la résine. <ol><li> Précipiter les produits peptidiques bruts avec de l&#39;éther éthylique anhydre froid (Et 2 O) en drainant la solution de l&#39;étape 1.6 dans 40 ml d&#39;Et 2 O, tourner vers le bas ce à 4 ° C et 4000 x g pendant 20 - 25 min. Répétez cette étape pour permettre le lavage du précipité avec anhydre froid Et 2 O. </li><li> Remettre en suspension les précipités dans l&#39;eau (5 ml ou jusqu&#39;à ce précipité est complètement dissous) et lyophiliser. Ensuite, remettre en suspension les produits obtenus dans 0,1% de TFA aqueux / acétonitrile. </li></ol></li> &lt;li&gt; Effectuer l&#39;analyse HPLC avec une colonne analytique C18 (5 pm, 4 x 150 mm) pour analyser chaque peptide. Utiliser une vitesse d&#39;écoulement de 1 ml / min, et la détection à 214 nm et 550 nm. </li><li> Effectuer HPLC semi-préparative sur une colonne de 10 x 250 mm C18 pour la purification des peptides. Utiliser un débit de 4 ml / min, et la détection à 214 nm et 550 nm. Pour tous les essais, en utilisant des gradients linéaires de TFA aqueux à 0,1% (solvant A) et 90% d&#39;acétonitrile, 9,9% d&#39;eau, et 0,1% de TFA (solvant B). </li><li> Confirmer l&#39;identité exacte des peptides par MALDI-TOF selon le protocole du fabricant: fTAT, masse attendue: 2,041.17, masse observée: 2040,66. DEAC-K9, masse attendue: 1,412.97, a observé de masse: 1,415.59. Utilisation d&#39;une matrice d&#39;acide α- cyano-4-hydroxycinnamique à la MALDI-TOF. </li></ol> 2. Réaction d&#39;oxydation: Génération dfTAT <ol><li> Aérer solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 pendant 1 h (au moins 5 ml pour la réaction ci-dessous). </li><li> Dissoudre fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) dans aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Assurez-vous que le pH est compris entre 7,0 - 7,5 après l&#39;addition du peptide. Sinon ajouter de l&#39;hydroxyde de sodium (1 M, par petits incréments de 1 à 5 pl) pour porter le pH jusqu&#39;à 7,4 avant. </li><li> Remarque: L&#39;oxygène dissous dans du PBS agit de façon à oxyder les groupes thiols sur fTAT et former une liaison disulfure. </li><li> Nutation la réaction O / N afin de lui permettre de réagir jusqu&#39;à achèvement (rendement de 100% sur la base de l&#39;analyse par CLHP). On purifie le produit en utilisant HPLC en phase inverse et analyse par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) comme dans l&#39;étape 1.9. Masse attendue: 4,080.34, a observé de masse: 4,084.21. </li><li> Lyophiliser pur dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) et remettre en suspension dans 200 pi d&#39;eau (concentration pur dfTAT = 356,3 M). </li></ol> 3. Mesurer dfTAT Concentration <ol><li> Remettre en suspension une portion aliquote de la dfTAT (typiquement 1 pi en fonction de la quantité de peptide purifié) purifié dans une solution de 149 ul de 50 mM de TCEP. </li><li> Remarque: Dans cette étape dfTAT est réduite à sa moNomer homologue fTAT pour éliminer la trempe d&#39;absorbance qui se produit en raison de la proximité du fluorophore TMR dans dfTAT (l&#39;ε du coefficient d&#39;extinction de la TMR dans dfTAT est réduite par rapport à la ε de TMR dans fTAT réduite). </li><li> Laisser l&#39;échantillon de réagir pendant environ 20 min (HPLC analytique peut être utilisé pour confirmer la formation de fTAT). </li><li> Ajouter toute la solution dans la cuvette de quartz et de mesurer l&#39;absorbance à 556 nm. </li><li> En utilisant la loi de Beer (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1) pour calculer la concentration de fTAT, déterminer la concentration de dfTAT, et de diviser [fTAT] par deux. </li></ol> 4. Les expériences de livraison cellulaires <ol><li> Ensemencer les cellules (HeLa, HDF, etc.) Dans un plat à une confluence de 80 - 90% (par exemple, 8 puits ou à 24 puits plat). Cultiver des cellules dans un milieu approprié (par exemple, DMEM complété avec 10% de FBS et Pen / Strep) jusqu&#39;à ce que 80 - 90% de confluence dans un 37 ° Catmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules trois fois (3 x) avec du PBS (par addition de 200 pl de PBS et ensuite l&#39;élimination trois fois). </li><li> Faire une concentration de travail de 5 uM de dfTAT en diluant un stock de dfTAT (dans l&#39;eau) dans la LNR-15 médias (pour un 8 bien plat le volume total devrait être de 200 pi). Une concentration de 5 uM dfTAT conduit à une prestation efficace (niveau élevé de la livraison cytosolique dans plus de 90% de cellules présentes dans un plat) dans la plupart des types de cellules testés à ce jour (Figure 3). Cependant, les concentrations inférieures ou supérieures pourraient être plus adéquat pour les types de cellules avec une propension élevée ou faible pour la pénétration. NOTE A PROPOS DE MEDIA: NRL-15 est utilisé pour la livraison de dfTAT car il ne contient pas de cystéine qui pourrait réduire la liaison disulfure dans dfTAT. Cependant, nos données indiquent que le paquet régulier L-15 (avec de la cysteine) et DMEM peut être utilisé comme support de livraison. L-15 contient la cystéine d&#39;acides aminés mais la réduction de la cystéine presumabLy oxyde dans les médias pour former la cystine (DMEM est formulé avec la cystine). dfTAT reste donc intacte dans ces milieux et la livraison fonctionne avec la même efficacité que celle obtenue avec nrL15. </li><li> Incuber les cellules avec dfTAT (5 uM) avec ou sans cargaison (par ex., EGFP (10 M)) et conserver à 37 ° C pendant 1 heure (temps d&#39;incubation peut être réduite, mais dfTAT nécessite généralement environ 30 à 45 min pour induire une fuite endosomiale ). </li><li> Laver les cellules avec de l&#39;héparine (1 mg / ml) dans du L-15 (3 lavages sont recommandés) pour éliminer dfTAT lié à la membrane plasmique des cellules. </li><li> Incuber les cellules avec coloration nucléaire de cellule imperméable, par exemple., Bleu Sytox, Sytox Green (2 pM dans NRL-15), afin de déterminer si la membrane plasmique des cellules est compromise (cellules mortes sont colorées alors que les cellules vivantes ne sont pas) selon la le protocole du fabricant. </li><li> Cellules image en utilisant un microscope à fluorescence (100X à immersion d&#39;huile ou d&#39;un objectif 20X). DfTAT image en utilisant un filtre de demande de propositions (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Remarque: La prestation réussie conduit à une fluorescence diffuse des dfTAT toute la cellule (évaluation de la prestation de protéine ou un peptide d&#39;intérêt dépendra de l&#39;application). La coloration des nucléoles par fTAT (le produit réduit lors de l&#39;entrée de dfTAT cytosolique) peut être utilisé comme une indication que la fluorescence détectée est intracellulaire. fTAT se dégrade en quelques heures. À ce stade, la fluorescence des fragments de dégradation apparaît comme ponctuée. Cela ne devrait pas être confondu pour la distribution ponctuée qui est également considéré si dfTAT reste sans succès piégé à l&#39;intérieur des endosomes (cela peut arriver si dfTAT est présent à une trop faible concentration). </li></ol> 5. Controling Concentration de MOI Livré <ol><li> Identifier la concentration &quot;de livraison optimale&quot; nécessaire pour obtenir la libération cytosolique efficace de dfTAT dans le type de cellule utilisée. Effectuer la microscopie par fluorescence sur des cellules incubées avec increasing concentrations de dfTAT. La concentration optimale dfTAT est définie comme la concentration minimale qui conduit à effacer cytosolique &quot;diffuser&quot; TMR fluorescence à environ 100% des cellules dans une culture. </li><li> Varier la concentration de MOI utilisé dans le protocole de co-incubation tout en gardant la concentration de dfTAT constante (par exemple, en utilisant une concentration de livraison optimale de dfTAT). Modification de la durée d&#39;incubation à moins de 1 h pourrait également être une option pour varier la quantité de MOI livré. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Les cellules utilisées pour la livraison dfTAT ne devrait pas être trop confluentes (&gt; 90% de confluence) car cela pourrait affecter l&#39;efficacité de la livraison. Les cellules devraient également être en bonne santé: les cellules mortes à la culture peuvent libérer des fragments apoptotiques avec laquelle dfTAT peut interagir (par exemple, l&#39;ADN à partir de noyaux dégradées). Cela peut interférer avec l&#39;efficacité de la livraison et de la qualité de l&#39;imagerie. Les cellules doiv...

La livraison des protéines, des peptides ou de petites molécules cellulaires imperméable dans les cellules vivantes est souvent souhaitable dans de nombreuses applications biologiques ou biotechnologiques (imagerie cellulaire, des tests fonctionnels, reprogrammation cellulaire, etc.) 4.1. De nombreuses approches de livraison ont déjà été signalées, y compris une micro-injection, l&#39;électroporation ou l&#39;utilisation d&#39;agents de support (par ex., Des peptides de pénétration cellulaire telles que des lipides, TAT) 5-7. Chaque technique a généralement avantages et les inconvénients spécifiques qui pourraient rendre ces approches adéquates pour certaines applications, mais pas pour d&#39;autres. Questions courantes concernent l&#39;efficacité de livraison pauvres et / ou le manque de contrôle de la quantité de matériel est livré 8,9, la toxicité ou délétère impact physiologique 10,11, le manque de contrôle temporel, la livraison dans quelques cellules, mais pas dans toute une population (par ex., microinjection) 12, et de conjugaison complexe chimique ou formulation régimes 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Récemment, nous avons développé une stratégie de prestation roman qui contourne ces limitations. Cette stratégie repose sur un peptide appelé dfTAT (dimère de TAT fluorescent) 13. dfTAT est dérivé du peptide bien savoir cellule-pénétrant (RPC) TAT. dfTAT contient deux copies de disulfure lié TAT marqués avec le fluorophore tétraméthylrhodamine. Malgré leurs similitudes, TAT et dfTAT diffèrent de manière significative de l&#39;activité. TAT est généralement internalisé dans les cellules par endocytose. Ce RPC reste cependant la plupart du temps emprisonné à l&#39;intérieur des endosomes (ce qui généralement conduit à une distribution ponctuée du peptide dans les cellules lorsqu&#39;elles sont examinées par microscopie à fluorescence). Comme TAT, dfTAT est efficacement endocytose par les cellules. Cependant, dfTAT ne reste pas coincé à l&#39;intérieur des endosomes. Au lieu de cela, il assure la médiation de fuite de l&#39;endosome d&#39;une manière qui est extrêmement efficace. L&#39;activité de endosomolytique dfTAT peut alors être exploitée pour fournir des macromolécules par un essai d&#39;incubation simple. MÉNAGEMENT &quot;&gt; La compréhension actuelle du processus d&#39;exécution est le suivant. dfTAT induit macropinocytose. En conséquence, les cellules incubées avec dfTAT prennent des protéines solubles, des peptides ou de petites molécules (molécules d&#39;intérêt, MOI) présents dans les médias par le fluide en phase endocytose (voir figure 1). Les interactions entre dfTAT et MOI ne sont pas nécessaires dans la mesure où les deux entités de trafic en même temps à l&#39;intérieur de la voie d&#39;endocytose. Comme dfTAT atteint un certain seuil dans la lumière des organites d&#39;endocytose, on exprime l&#39;activité de fuite de l&#39;endosome (les détails moléculaires restent à être pleinement caractérisé). Le contenu de la lumière des organites qui fuient, et donc la MOI, est alors libéré dans les cellules. Cette approche est donc très pratique car aucun conjugaison ou de formulation des programmes avec MOI sont nécessaires. En outre, parce dfTAT est pas directement la modification d&#39;un MOI, il ne doit pas interférer avec la fonction IAM une fois que la délivrance intracellulaire est réalisée. En outre, la concentration dedfTAT utilisé livraison est indépendante de celle de MOI dans les médias. Par exemple, la concentration dfTAT peut être maintenue constante entre les différentes expériences pour garantir l&#39;efficacité de fuite reproductibles endosomal. En revanche, la concentration de la MOI dans les médias peut être progressivement modifié pour atteindre des niveaux souhaités de MOI livré dans le cytosol. L&#39;efficacité de fuite endosomal haute réalisé avec dfTAT est remarquablement inoffensifs pour la plupart des cellules testées à ce jour. Ceci est une surprise car organites d&#39;endocytose sont composante importante des cellules et on pourrait penser que la fuite dramatique médiée par dfTAT serait accompagnée par des réponses cellulaires délétères. Pourtant, les cellules traitées prolifèrent à la même vitesse que les cellules non traitées et ne présentent pas de changements significatifs dans leur transcriptome. En outre, la livraison peut être répété en quelques minutes avec des rendements de livraison reproductibles, ce qui indique que les cellules peuvent soit tolérer ou récupérer du processus de livraison sans perdreleur capacité d&#39;endocytose ou de fuite endosomal. Réponses cellulaires subtiles pourraient avoir lieu lors de la livraison dfTAT et les détails moléculaires de ce que ces réponses pourraient être restent à explorer. Pourtant, en alliant efficacité, commodité de protocoles, et l&#39;absence de toxicité, cette approche de la livraison devrait se révéler immédiatement utile dans de nombreuses applications à base de cellules. Les protocoles présentés ici visent à rendre cette technologie accessible à la communauté de recherche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Stratégies de prestation macromoléculaires utilisent généralement la voie d&#39;endocytose comme une voie d&#39;entrée cellulaire. Cependant, endosomal piégeage limite considérablement l&#39;efficacité avec laquelle macromolécules pénétrer l&#39;espace cytosolique des cellules. Récemment, nous avons contourné ce problème en identifiant le réactif dfTAT, un dimère de liaisons disulfure du peptide TAT de la tétraméthylrhodamine marqué avec un fluorophore. Nous avons généré un dimère marqué par fluorescence du peptide pénétrant dans les cellules (CPP) TAT prototypique, dfTAT, qui pénètre dans les cellules vivantes et atteint l&#39;espace cytosolique des cellules avec une efficacité particulièrement élevée. Cytosolique de livraison dfTAT est réalisé dans plusieurs lignées cellulaires, y compris des cellules primaires. En outre, la livraison n&#39;a pas d&#39;incidence sensiblement la viabilité cellulaire, la prolifération ou l&#39;expression génique. dfTAT peut délivrer de petites molécules, des peptides, des anticorps, des enzymes biologiquement actives et un facteur de transcription. Dans ce rapport, nous décrivons les protocoles impliqués dans DFTALa synthèse de T et la livraison cellulaire. Le manuscrit décrit comment contrôler la quantité de protéine délivrée à l&#39;espace cytosolique des cellules en faisant varier la quantité de protéine administrée de manière extracellulaire. Enfin, les limites actuelles de cette nouvelle technologie et les étapes impliquées dans la validation de la livraison sont discutées. Les protocoles décrits doivent être extrêmement utile pour les dosages à base de cellules ainsi que pour la manipulation ex vivo et la reprogrammation de cellules.

Afin d&#39;évaluer la différence entre fTAT et dfTAT, les cellules HeLa sont incubées pendant 1 heure avec chaque peptide pour déterminer la différence de leur localisation cellulaire. L&#39;internalisation du RPC de deux été évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence. La figure 2 montre que fTAT (20 uM) se localise dans une distribution ponctuée. Cette distribution est en accord avec le peptide restant piégé à l&#39;intérieur des endosomes. En revanche, le signal de fluorescence ...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vues.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Vidéo: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel nanoparticules récolte de plasma ou l&#39;urine pour la détection des protéines de faible abondance

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In Vitro perméation de ferritines FITC-chargés sur un Rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l&#39; étude de la prestation de Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Peptides antimicrobiens produites par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...