Name: a murine model of vertical sleeve gastrectomy
Uploaded: 2017-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
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Cette recherche a été financée par les NIH/NCI R21CA195002-01 a 1, Conseil du Président des femmes de Cornell et la SUNY Graduate Fellowship de la diversité. Laboratoire de Dr Cummings' a également reçu des fonds au cours de la période du projet de la Cornell Comparative programme de formation de Cancer Biology et Eli Lilly and Company.

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de l’emploi et de Cornell University Institutional Animal Care.
1. préparation pré-chirurgicale
NOTE : Souris de l’étude sont généralement sur un fond obèse C57BL induite par la diète de mener des études translationnelle pertinent à l’obésité humaine et résistance à l’insuline. Des souris mâles et femelles peuvent être étudiées comme décrit dans les étapes ultérieures.
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	<li>À l’âge de 2 mois, placer la souris sur un régime riche en graisses 45 % ou 60 % pendant 2 mois (voir Table des matières). Remarque : Les souris sont alimentés un régime riche en graisses pour créer un phénotype obèse et résistants à l’insuline. Des périodes plus courtes ou plus longues de l’alimentation de régime riche en graisses peuvent être utilisées selon les objectifs de l’étude.</li>
	<li>Continuer à alimenter la souris ad libitum jusqu'à ce que la chirurgie. Si des mesures de base sont nécessaires, après que 7 semaines de haute teneur en graisses diététiques alimentation, rapide souris pendant 6 h ou durant la nuit et prendre un échantillon de sang de base pour la mesure des métabolites d’intérêt (par exemple, le glucose).</li>
	<li>Continuer la souris sur la haute teneur en graisses diététiques et autoriser les souris une semaine pour récupérer après le prélèvement de sang avant la chirurgie de l’imposture ou VSG. Placez la souris sur un liquide diète (voir Table des matières) pour 4 jours avant la chirurgie. NOTE : Souris sont soumis à une diète liquide avant et après la chirurgie pour dégager le tube digestif des particules qui peuvent altérer la réponse de guérison.</li>
	<li>Stériliser les points suivants avant la chirurgie : clinquant, gaze, coton à bout des applicateurs (DEC) et les instruments chirurgicaux (pince hémostatique, ciseaux, ciseaux de l’iris, instrument de dumont, de fonctionnement dentelé instrument Adson-Brown, aiguille de gavage, pilote de micro aiguille, ciseaux de printemps ).</li>
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2. verticale gastrectomie et procédures Sham
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	<li>Le jour de la chirurgie peser la souris afin d’obtenir une mesure de poids de base.</li>
	<li>Équiper la salle chirurgicale avec un bain d’eau chauffée et système d’anesthésie, coussin chauffant. Mettre au bain-marie à 37 ° C et utilisez-le pour réchauffer des 0,9 % solution saline pour l’irrigation. Nettoyer le champ chirurgical avec l’éthanol à 70 % et utiliser une technique stérile pour ouvrir outils et pack de chirurgie autoclavés. Remarque : Le coussin chauffant est utilisé pour maintenir l’animal au chaud pendant la chirurgie et de l’anesthésie.</li>
	<li>À l’aide d’une chambre à induction, anesthésier la souris avec 5 % isoflurane et O2 débit de 1 L/min. Vérifiez que la souris est dans le plan approprié de l’anesthésie en effectuant une pincée d’orteil. Maintenir la souris avec l’isoflurane 1 à 3 % et un débit de2 O de 0,6 L/min une fois un plan cohérent de l’anesthésie a été atteint.</li>
	<li>Une fois que la souris est anesthésiée, placez la pommade ophtalmique (voir Table des matières) sur ses yeux pour les garder humides pendant la chirurgie. À cette époque également administrer un analgésique, comme meloxicam (2 mg/kg par voie sous-cutanée). Couper les cheveux de l’ombilic à l’aisselle maintenez doucement la peau pour fournir la tension.
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		<li>Comme la peau de la souris est fine et délicate, prendre soin ne provoque des lésions de la peau lorsque tondre le cheveux. Nettoyer la peau avec la povidone-iode et d’alcool.</li>
		<li>Enfiler des gants stériles et préparent le champ opératoire stérile et instruments. Effectuer le reste de la procédure en utilisant une technique stérile. Préparer le champ opératoire stérile en plaçant des draps chirurgicaux stériles de chaque côté de la souris. Feuille d’étain autoclavée permet de créer un drapé chirurgical pour la souris.</li>
		<li>Découper un petit trou dans le papier d’aluminium pour permettre l’accès dans l’abdomen de la souris.</li>
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	<li>Faire une incision de la peau depuis le milieu de l’abdomen (ombilic) au niveau du cartilage xiphoid à l’aide d’un ciseau de l’iris. Identifier la linea alba et utilisation iris ciseaux pour couper à travers la paroi du corps le long de la linea alba. ETG permet d’élever doucement l’estomac hors de l’abdomen et puis carrément disséquer l’épiploon grandes hors de la grande courbure de l’estomac.</li>
	<li>Ligaturer l’artère gastrique courte qui s’étend entre le fundus de l’estomac et la rate en plaçant deux ligatures à l’aide d’une suture résorbable monofilament 7-0. Utiliser des ciseaux de printemps pour couper entre les deux ligatures. Une fois que l’artère est traversée, entièrement extérioriser l’estomac dans la cavité abdominale. Placez la gaze dans l’estomac et humide avec du sérum physiologique pour garder le tissu humide.</li>
	<li>Intervention factice
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		<li>Pour l’intervention factice, placer un motif continu simple lâche de suture résorbable de monofilament 6-0 grâce à une aiguille conique. Commencer 2 mm vers la droite (droite du chirurgien) de l’oesophage. Placez la ligne de suture le long de la paroi gastrique ventrale et continuez le long de la paroi gastrique dorsale. Remarque : Pour toutes les manipulations gastriques, utilisez uniquement une suture résorbable monofilament pour diminuer le risque d’infection. En outre, utiliser seulement de suture avec une aiguille conique pour toutes les manipulations gastriques, comme l’utilisation d’une aiguille de coupe augmente le risque de suture « jeté » menant aux dommages de tissu gastrique et une déhiscence de plaie.</li>
		<li>Passer l’aiguille complètement à travers une paroi gastrique en plaçant la suture. Assurez-vous que la suture est plat, mais ne limitant ne pas l’estomac. Doucement, attacher la suture désactivées à l’aide de 3-4 lancers et passez à l’étape 2,9.</li>
		<li>Pour la procédure VSG, sautez l’étape 2.7 et passez à l’étape 2.8.</li>
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	<li>Procédure VSG
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		<li>Pour la procédure VSG, ligaturer les branches importantes de l’artère gastrique et la veine avec 7-0 résorbable monofilament avec une aiguille conique à l’aide de 3 lève pour chaque noeud. Placez les ligatures juste en dessous (c'est-à-direvers la petite courbure de l’estomac), la ligne de transection. Remarque : La ligne de transection commence à environ 2 mm au-dessus (sens vers la grande courbure de l’estomac) l’encoche cardiaque de l’estomac et au moins 2 mm en dessous de la pilcatus de margo et s’étend à l’extrémité proximale du lobe droit du pancréas. En général, il y a 4 vaisseaux par la paroi gastrique qui doivent être ligaturé ; Toutefois, cela peut varier entre souris.</li>
		<li>Pour éviter toute fuite du contenu gastrique au cours de la gastrectomie, placez une simple ligne de suture passant par ces deux parois gastriques juste en dessous de la ligne de transection utilisant une suture résorbable monofilament 6-0 avec une aiguille conique continue. Commencer la ligne de suture à droite du chirurgien de l’oesophage et en dessous le margo pilcatus et la fin juste au dessus du pancréas.</li>
		<li>Posez hémostatique à pointe mince au-dessus de la ligne de suture et printemps ciseaux pour couper entre la ligne de suture et une pince hémostatique. Retirez le tissu gastrique percement du champ opératoire stérile.</li></ol></li></ol>DEC permet de nettoyer le sang et digesta hors de l’estomac.
		<li>Renforcer l’apposition des parois gastriques à l’aide de suture résorbable de monofilament 6-0 avec une aiguille conique à l’aide d’un simple modèle discontinu. Remarque : Un modèle simple suture discontinus est recommandé car cela permet une fermeture plus sûre que le modèle simple suture continue.</li>
		<li>Rincer le vestige gastrique avec une solution saline dans l’ensemble de la procédure afin de maintenir le tissu humide et propre. Utiliser une aiguille de gavage de 20G attachée à une seringue de 20 mL pour effectuer un lavage gastrique avec une solution saline. Cette taille permet d’assurer une pression adéquate est fournie sans risquer des dommages de tissu gastrique d’une pression excessive ou dommages accidentels tissu gastrique de l’utilisation d’une aiguille pointue ordinaire.</li>
		<li>Utiliser un minimum de 20 noeuds pour fermer solidement l’estomac ; Faites attention à la fermeture le long du côté de l’oesophage, car ce côté est plus difficile d’accès et est donc souvent un site de déhiscence.</li>
		<li>S’assurer qu’il n’y a pas de fuite en pressant doucement sur le ventre avec l’ETG. Si les fuites sont détectées, placer les nœuds discontinues simples supplémentaires sur les zones de fuites et test de fuite puis à nouveau. Essai d’étanchéité jusqu'à ce qu’aucune fuite n’est détecté.</li>
		<li>Faire un lavage complet final de l’estomac à l’aide d’au moins 60 mL de solution saline pour s’assurer qu’aucune matière particulaire infectieuse n’a été laissée.</li>
	
	
	<li>Replacer l’estomac dans la cavité abdominale sous le foie à l’aide d’une DEC. Placez des DEC le long de la face dorsale de la cavité abdominale pour absorber tous les excès de liquide. À l’aide d’une aiguille 18G émoussée, injecter une solution de Ringer amorcez (LRS) avec ou sans antibiotiques (0,5 mL LRS +/-20 mg/kg enrofloxacine) directement dans la cavité abdominale, juste avant la fermeture. Remarque : Cela remplace la perte liquidienne expérimentés pendant la chirurgie et fournit une méthode pour l’application directe des antibiotiques au site de la chirurgie aider à la récupération.</li>
	<li>Fermer la couche de muscles abdominaux à l’aide de suture résorbable de monofilament 6-0 avec une aiguille conique dans un simple modèle discontinu. Puis fermez la couche de peau avec suture résorbable de monofilament de 6-0 dans un motif continu simple.</li>
	<li>Placer l’adhésif de tissu sur la peau et replier la peau sur la ligne de suture d’enterrer la suture pour que la souris ne peut pas perturber la fermeture de la plaie après l’opération.</li>
	<li>Éteignez l’isoflurane et laisse la souris à récupérer sur le coussin chauffant pour 10-15 minbefore remettre dans sa cage maison. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris conscience et est capable de se déplacer.</li>
	<li>Garder les animaux hébergés séparément jusqu'à ce que complètement remis de la chirurgie. Remarque : Si les mesures de l’apport alimentaire précis doivent être obtenus tout au long de l’étude, souris devraient continuer à être logés individuellement tout au long de l’étude. Il y a un risque d’obstruction de corps étranger de manger literie maison cage. Animaux doit être logés dans des cages sans literie à l’exception des matériaux permettant l’enrichissement de nidification (voir Table des matières).</li>

3. mesures et la souris post-opératoire soins
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	<li>Retourner la souris à sa cage maison et placer la cage sur un coussin chauffant. Maintenir la souris sur une diète liquide pendant au moins 7 jours après la chirurgie. Administrer un analgésique, comme meloxicam (2 mg/kg par voie sous-cutanée), pendant 2 jours après la chirurgie. Remarque : Un antibiotique, comme enrofloxacine (20 mg/kg), peut être donné jusqu'à 7 jours après la chirurgie. Antibiotiques sont donnés afin de minimiser les risques d’infection par l’intervention chirurgicale et peuvent ou ne peuvent être exigés selon le taux de stérilité maintenu tout au long de la procédure. Toutefois, si les antibiotiques sont utilisés, ils doivent être administrés à toutes les souris dans la même étude pour maintenir la cohérence.</li>
	<li>Au cours de la période post-opératoire évaluer le poids corporel, la prise alimentaire, défécation, niveau d’activité et la destruction au moins tous les jours pour assurer la bonne guérison et la récupération. Effectuer une surveillance post-opératoire pendant 14 jours après la chirurgie. NOTE : Échec chirurgical est généralement vu immédiatement après l’intervention ou dans les trois jours après per-opératoire. Les animaux qui ne sont pas manger ou boire le deuxième jour après la chirurgie doivent être étroitement surveillés complications chirurgicales.</li>
	<li>Après avoir complété avec succès la période post-opératoire, mesurer la prise de poids et de l’alimentation corps régulièrement tout au long de l’étude pour assurer la maintenance du phénotype approprié.</li>
	<li>Effectuer une épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) afin d’évaluer la tolérance au glucose, la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose et vider la sécrétion de l’hormone.
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		<li>Effectuer la HGPO chez la souris après avoir jeûné pour 6 h et puis souris gavage avec une solution de dextrose de 50 % à une dose de 1 g/kg.</li>
		<li>Recueillir des échantillons de sang de queue à 0, 2.5, 5, 15, 30, 60 et 120 minutes après le gavage. Mesurer la glycémie avec un glucomètre à ces moments. Prélever des échantillons de sérum à chaque instant pour la mesure de diverses hormones, comme l’insuline et GLP-1.</li>
		<li>Souris rapides pendant 6 h avant l’euthanasie. Prendre une mesure d’échantillon et le glucose de sang final. Comparer la mesure finale de glucose à la mesure de référence. Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital à une dose de 200 mg/kg.</li>
		<li>Remplissez la base et des échantillons de sérum final autres analytes et comparer les valeurs de chirurgie préalables et post-opératoires.</li>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+sleeve+gastrectomy+restores+glucose+homeostasis+in+apolipoprotein+A-IV+KO+mice.">Vertical sleeve gastrectomy restores glucose homeostasis in apolipoprotein A-IV KO mice.</a> Diabetes. 64 (2), 498-507 (2015).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, sauf Dr Cummings a reçu un financement de Eli Lilly and Company.

La chirurgie bariatrique est le traitement le plus efficace à long terme de l’obésité et se traduit par d’autres avantages pour la santé tels que des taux élevés de type 2 diabète et l’hypertension remise1,9,15. Les modèles murins de la chirurgie bariatrique offrent un outil puissant permettant d’identifier les mécanismes par lequel la chirurgie bariatrique provoque des améliorations rapides et prononcées en m...

Comme l’épidémie d’obésité continue de croître dans le monde entier la chirurgie bariatrique a gagné en popularité comme c’est le traitement le plus efficace à long terme pour l’obésité1. Malheureusement, la perte de poids par l’alimentation et l’exercice est difficile à réaliser et relativement inefficace sur le long terme2,3. La chirurgie bariatrique, comme la gastrectomie verticale (VSG), est définie comme la manipulation de l’appareil gastro-intestinal dans le but de perte de poids1,4. Bien que la perte de poids est un résultat important de la chirurgie bariatrique, chirurgie bariatrique fournit d’autres avantages de santé comme l’amélioration des comorbidités de l’obésité et prolongeant la durée de vie5. Par exemple, la chirurgie bariatrique entraîne des taux élevés de rémission de diabète de type 2 et l’hypertension et réduction du risque de durée de vie du développement de certains types de cancer1,6,7. À noter l’effet de la chirurgie bariatrique causant la rémission de l’hypertension et de diabète de type 2 est souvent observé peu de temps après la chirurgie et avant la perte de poids8,9. Cela met en évidence la notion qu’il existe des mécanismes indépendants de poids corporel qui contribuent aux bienfaits observés après la chirurgie. Des modèles animaux de la chirurgie bariatrique ont été développés et sont utilisées pour étudier les mécanismes par lesquels ces bienfaits pour la santé produisent10,11,12.
Nous avons validé un modèle murin de VSG, dont nous avons appliqué à divers modèles de souris génétiquement modifiées pour étudier les mécanismes par lesquels la chirurgie bariatrique améliore comorbidités l’obésité comme le diabète de type 2, d’hypertension et de cancer colorectal10 , 11 , 12. les modèles de rongeurs permettent contrôle plus expérimental et la possibilité d’effectuer des manipulations génétiques ou pharmaceutique pour définir le rôle des gènes spécifiques ou des voies de signalisation d’intérêt. Nous nous concentrons principalement sur VSG VSG étant la procédure bariatrique plus couramment pratiquée à la clinique dans les États-Unis13. En outre, VSG est un modèle chirurgical simple avec des modifications anatomiques moins par rapport à d’autres procédures telles que détournement de dérivation ou de dérivation biliopancréatique gastrique Roux-en-Y.
Notre modèle de souris de VSG récapitule les effets d’une chirurgie bariatrique observées chez les humains : perte de poids, la prise alimentaire réduite, régulation du glucose améliorée, amélioration de la fonction de l’îlot, a augmenté la sécrétion postprandiale le glucagon-like peptide-1 (GLP-1), réduit la tension artérielle et augmentation circulant acides biliaires des concentrations10,11,12,13,14,15. Par conséquent, il s’agit d’un modèle idéal pour étudier les corps poids dépendantes et indépendantes mécanismes par lesquels VSG améliore ou résout des comorbidités de l’obésité. En outre, c’est un modèle fiable qui peut être combiné avec d’autres interventions chirurgicales, permettant la recherche sur l’impact du VSG dans diverses conditions de maladie avec une plus grande perspicacité mécaniste12.

<table><tbody><tr><td>45% high fat diet</td><td>Research Diets</td><td>D12451</td><td></td></tr><tr><td>60% high fat diet</td><td>Research Diets</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Boost</td><td>Nestle</td><td>160-67538</td><td>rich chocolate flavor</td></tr><tr><td>6-0 Suture</td><td>Ethicon</td><td>Z432</td><td>monofilament absorbable/taper</td></tr><tr><td>7-0 Suture</td><td>Covidien</td><td>8866127-01</td><td>monofilament absorbable/taper</td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-118</td><td>small</td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>233-400-101</td><td>large</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Various</td><td></td><td>4x4 4 ply and 2x2 4 ply</td></tr><tr><td>Foil</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery drape</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LRS</td><td>Hospira</td><td>170RX</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye Ointment</td><td>Paralube&amp;reg; Vet Ointment</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>141-213</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Enrofloxacin</td><td>Baytril</td><td>08713254-186599</td><td>22.7 mg/ml</td></tr><tr><td>Thin tipped hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14018-18</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forcep</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Serrated Forcep</td><td>Fine Science Tools</td><td>11020-12</td><td></td></tr><tr><td>Gavage needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>18060-20</td><td></td></tr><tr><td>Microneedle driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-14</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL syringe</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20mL syringe</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucometer (one touch ultra mini)</td><td>Lifescan</td><td>70021208</td><td></td></tr><tr><td>Multiplex insulin and GLP-1 kit</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>K15171C-1</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.00</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td></td></tr></tbody></table>

a murine model of vertical sleeve gastrectomy

La chirurgie bariatrique, comme la gastrectomie verticale (VSG), est une intervention chirurgicale du tube digestif qui est effectuée dans le but de perdre du poids. La chirurgie bariatrique est actuellement le traitement le plus efficace à long terme de l’obésité. En plus de la perte de poids, la chirurgie bariatrique produit des bienfaits supplémentaires comme la remise de la rémission de l’hypertension artérielle, diabète de type 2 et diminue le risque de développer certains types de cancer. Les mécanismes au-delà de la perte de poids pour ces prestations restent incomplètement. Par conséquent, les modèles animaux de la chirurgie bariatrique soient développées et validées pour identifier les mécanismes qui conduisent à ces avantages, dans le but d’améliorer la compréhension de la physiologie digestive et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Générateur de signaux vectoriels est devenue la procédure bariatrique plus couramment pratiquée à la clinique aux États-Unis parce que c’est très efficace dans la production de perte de poids et l’amélioration métabolique et est plus simple à réaliser que les autres procédures bariatriques. Par conséquent, nous avons développé et validé un modèle murin de VSG. Ce modèle murin de VSG reprend bon nombre des effets de VSG vu chez l’homme, y compris la réglementation améliorée de glucose et de la pression artérielle. La méthode repose sur l’isolement de l’estomac, la ligature des vaisseaux gastrique et l’enlèvement des 70 % de l’estomac en sectionnant le long de la grande courbure de l’estomac. Nous avons appliqué avec succès ce protocole chirurgical de diverses lignées de souris génétiquement modifiés pour définir les contributeurs mécanistes aux avantages de la VSG. En outre, ce modèle murin de VSG a été combiné avec d’autres techniques chirurgicales, pour atteindre une connaissance mécaniste. Par conséquent, il s’agit d’un modèle simple et versatile pour étudier la physiologie digestive et les bienfaits de la chirurgie bariatrique.

Les trompe-l'œil et les procédures VSG sont représentés dans la Figure 1. Figure 1 a montre où la ligne de suture est placée le long des parois gastriques au cours de l’intervention factice. Cette même zone est où l’estomac est coupé pendant la chirurgie VSG. Figure 1 b montre le vestige tubulaire de gauche de l’estomac après exécution du générateur de signaux vectoriels.
<p cl...

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A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

La section suivante décrit les performances de gastrectomie verticale chez les souris. Il s’agit d’un type de chirurgie de perte de poids qui implique le retrait d’environ 70 % de l’estomac.

Un modèle murin de gastrectomie verticale

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

a-murine-model-of-vertical-sleeve-gastrectomy

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K vues.  Cornell University. La section suivante décrit les performances de gastrectomie verticale chez les souris. Il s’agit d’un type de chirurgie de perte de poids qui implique le retrait d’environ 70 % de l’estomac.

Vidéo: A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Murine Pancreatic Islet Isolation

Hi, I am Greg Zott. I'm with the UCSF Diabetes Center in the Bluestone Laboratory, and today I'm gonna show you the process for isolating mouse eyelets. The procedure involves the injection of a collagenase solution into the pancreas of a C3 H donor mouse, where we will then remove that pancreas, digest it away, purify the eyelets on a fial gradient, and then handpick them for ultimate transplant into the kidney capsule of a diabetic NOD mouse, Which will be our recipient.Before we start this procedure, we diluted our ATE solution in a modified Hanks buffer and we have adjusted the concentration specific for the strain of mouse that we're using the C3 H.We found digests better at a 0.8 mgs per mil collagenase solution, and we will use that to inject into the common bile duct to distend the pancreas.Performing. The procedure today Will be Pavo codre of the diabetes center. He will inject, open up the mouse, expose the the intestines, and then inject into the common bile duct.We will spray down the mouse with ethanol to keep the hair down, and then we will also verify that the mouse has been sacrificed properly with a toe pinch. Pavo will now open up the mouse and exposing the intestine and the pancreas with a midline incision. The diaphragm will also be cut to verify that the mouse will be sacrificed.Before we get started, I'd like to point out some of the important structures. The stomach is lying right here with the pancreas attached underneath into the duodenum and above. This is the liver where we'll find the gallbladder and the common bile duct, which you can see right here.So what Pavo will do next is he will isolate the small intestine, find where the common bile duct enters the small intestine. Once the intestine is exposed, we clamp on either side of the common bile duct with mosquito clamps. We find that this allows more collagenates to enter the pancreas while other groups try to direct the clamp on top of the common bile duct.We find that this is a better technique in allowing enzyme to enter the pancreas. This is a gentle procedure. You don't want to tear the bowel.You wanna allow the clamps to lie gently on either side of the common bile duct. Now we will find a gallbladder, and once the gallbladder's exposed, we will use that as a guide to injecting the collagenase into the common bile duct. Powell's using a 30 gauge needle with a five cc syringe containing three mills of collagenase solution.As he's entering the common bile duct, he's distending that duct with collagenase solution and then he travels down the common bile duct till he reaches near the intestine. And as he's going down, the enzyme solutions being pumped into the injected into the pancreas. Now that the pancreas is inflated with collagenase solution, Powell's gonna remove the hemostats and then remove the pancreas from the the mouse carefully tearing it away from the intestine.He removes it from the stomach. Okay, and then using the spleen as a handle, he lifts up the pancreas and then slowly snips it away in the common bile duct, and that's it. Pancreas is laid out and then the spleen is removed, and there he's removing the meso enteric tissue, and then the pancreas is placed in a two mill collagenase solution and a sterilized glass vial and it's placed back on Ice.The isolated pancreas that we put into the glass vials will now be placed into a 37 degree water bath for approximately 17 minutes. We placed them into a 50 mil conical rack so that they don't float up. Once during the bath, the timer starts and the digestion begins.Once the digestion time is completed, vials are removed, and then they are shaken and disrupted gently. And once the tissue starts falling apart, the vial is then placed on ice. A sterile screen is placed over a 400 mil beaker that contains washing buffer.The pancreas digest is then carefully poured over the screen into the wash buffer. For demonstration purposes, the hood has been turned off and the glass of the hood has been raised so we could see what we're doing. Once the pancreas digest is poured into the beaker, the vials are rinsed with the same washing buffer and the wash buffer placed over the screen.We have a syringe filled with washing buffer. We will use that to forcefully wash the tissue through the screen. The idea is to release any loose eyelets that are unattached to the matrix, but leaving the membranes and the undigested tissue on the screen.And when you're finished washing a tissue, this is what you usually See at the end of the procedure. The Pancreas tissue that's in the bottom of the tube will now be transferred to two 50 mil conical, and the tissue will be washed, the tissue's mixed evenly, and then distributed evenly so that we have a equal pellet volume in each tube. The beaker is now rinsed with more washing buffer.The sides are rinse so that you get all tissue that is entered the beaker again. Then it's equally distributed between each two, both 50 mil. Conical then are topped off with wash buffer.The tissue is inverted several times and then placed into a centrifuge. This is a quick spin. The centrifuge is allowed to reach a thousand RPM and then is turned off.The tissue at this time is very S eyelets are very sensitive, and you don't want to over compact them. The tubes are removed and we will do this wash step three more times. This is the end of the third wash.The components of the 50 mil conical tube are transferred to the 15 conical tube and centrifuge for a thousand RP M and then stopped. The supernat will be removed and the first part of the FI Call will be started. We are at the step where we Have our pelleted di pancreas digest.We'll resuspend that tissue so it's nice and loose to the pellets. We'll add the first density gradient, which is 1 1 0 8. We'll add five mils to each tube.The pellet is then mixed thoroughly in each of the gradients. It's important that you get good tissue distribution in your heaviest gradient. Now we will layer two mils of 1 0 9 6 density.We will then on top of that, layer two mils of 1 0 6 9 density, and then on top of that 1 0 3 7 density. It's important while you're layering the densities that you don't mix. Then all the layers have been added to the tube.And you can see this is the top of 1 1 0 8, the top of 9 1 0 9 6, the top of 1 0 6 9 and the top of 1 0 3 7. And you could see the tissue is already starting to move to its proper density even without centri fusion. The fial gradients are brought up to speed at 1800 RPM for 15 minutes, and remember to keep the brake off after the tubes are removed from the centrifuge.You can see between the 0 0 9 6 and 0 0 7 layer, there's a nice band of eyelet tissue Pablo's. Now removing the 0 3 7 layer to remove any tissue debris and DNA that might have been released during the processing. Using a sterile plastic pasture pipette, he will now remove the islet layer and transfer them to a 50 mil conical containing 25 mils of wash buffer.You want do this step quickly because fol is toxic to eyelets. We actually removed the entire 0 6 9 and 0 9 6 layer. Pavo cuts the top of the plastic pasture pipette and rinses it with wash buffer.The eyelets are then centrifuge like we centrifuge previously. Centrifuge is brought up to a Thousand RPM and then we stop it and We aspirate off. The supernatant eyelets will be washed three times with wash media.So we just completed the eyelid Isolation process we took from the digest to the fol gradient to the purified eyelets after our third wash with wash buffer, we resuspended the eyelets in our RPMI media and we played it in a tissue culture plate. These eyelets are now ready for in vitro assays or in vivo preps like eyelet Transplant.

Isolement murin îlots pancréatiques

Recherche

Biologie

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modèle murin d&#39;ischémie des membres postérieurs

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murin procédure transplantation rénale

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Modèle murin de la maladie de Parkinson: de lésion dopamine 6-OH au test comportemental

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

DAL-Ligature: un modèle murin d&#39;infarctus du myocarde

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Techniques of Sleeve Gastrectomy and Modified Roux-en-Y Gastric Bypass in Mice

Obesity is a major public health issue, with a prevalence of 4 to 28% for men and 6.2 to 36.5% for women in Europe (from 2003 to 2008). Morbid obesity is frequently associated with metabolic complications, such as type 2 diabetes, hypertension, and dyslipidemia, reducing life expectancy and quality. In the absence of any effective noninvasive treatments, bariatric surgery is a valuable therapeutic option for patients with morbid obesity (body mass index (BMI) &#62;40 kg/m2), leading to long-term, sustained weight loss and improvements in metabolic complications. However, the underlying cellular and molecular mechanisms sustaining the beneficial effects of bariatric surgery are not yet fully understood. Due to the numerous genetically-modified strains available, the mouse model is the most convenient animal model to explore the molecular mechanisms behind the pleiotropic beneficial effects of bariatric surgeries. Here, we detailed the optimized healthcare methods and surgical protocols in mice for the two most widely-used bariatric surgeries: the sleeve gastrectomy and the modified Roux-en-Y gastric bypass. Deciphering the molecular mechanisms underlying the therapeutic effects of bariatric surgeries offers the promise of identifying new therapeutics targets.

Bariatric surgery is the most efficient way to reduce body weight and the deadly metabolic complications (diabetes, obesity, and dyslipidemia) frequently associated with morbid obesity. Mouse models of bariatric surgery represent a unique asset for deciphering molecular mechanisms behind the beneficial effects of these surgeries on diabetes, hypertension, and dyslipidemia.

Techniques de sleeve gastrectomie et modification Roux-en-Y bypass gastrique chez la souris

Obesity is a major public health issue, with a prevalence of 4 to 28% for men and 6.2 to 36.5% for women in Europe (from 2003 to 2008). Morbid obesity is ...

Médecine

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d&#39;insectes pour les études biophysiques

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the increased universal phenomenon of type 2 diabetes (T2D) and other metabolic problems. Bariatric surgery, such as SG, is currently one of the most effective and commonly used long-term treatment for obesity and T2D, but the association between them is not completely explored yet. The mechanisms underlying the outcomes seen after bariatric surgery in humans can be investigated based on preclinical animal studies. The SG reduces body weight, glucose levels and many metabolic parameters, and is easy to perform with a low incidence of complications. The goal of this work is to provide a simple method and an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery in animals for researchers.

The prevalence of diabetes and obesity is continuously increasing worldwide. The mechanisms between diabetes, obesity and their associated mortality and co-morbidities need to be further investigated. Here, we present a protocol for sleeve gastrectomy (SG) in animals as an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery.

Gastrectomie à manches chez les souris à l’aide de clips chirurgicaux

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the ...

Single-Anastomosis Duodeno-Ileal Bypass with Sleeve Gastrectomy Model in Mice

Obesity is a major health issue worldwide. As a response, bariatric surgeries have emerged to treat obesity and its related comorbidities (e.g., diabetes mellitus, dyslipidemia, non-alcoholic steatohepatitis, cardiovascular events, and cancers) through restrictive and malabsorptive mechanisms. Understanding the mechanisms by which these procedures allow such improvements often require their transposition into animals, especially in mice, because of the ease of generating genetically modified animals. Recently, the single-anastomosis duodeno-ileal bypass with sleeve gastrectomy (SADI-S) has emerged as a procedure that uses both restrictive and malabsorptive effects, which is being used as an alternative to gastric bypass in case of major obesity. Thus far, this procedure has been associated with strong metabolic improvements, which has led to a marked increase in its use in daily clinical practice. However, the mechanisms underlying these metabolic effects have been poorly studied as a result of a lack of animal models. In this article, we present a reliable and reproducible model of SADI-S in mice, with a special focus on perioperative management. The description and use of this new rodent model will be helpful for the scientific community to better understand the molecular, metabolic, and structural changes induced by the SADI-S and to better define the surgical indications for clinical practice.

Single-anastomosis duodeno-ileal bypass (SADI-S) is an emerging bariatric procedure with important metabolic effects. In this article, we present a reliable and reproducible model of SADI-S in mice.

Dérivation duodéno-iléale à anastomose unique avec modèle de gastrectomie à manchon chez la souris

Obesity is a major health issue worldwide. As a response, bariatric surgeries have emerged to treat obesity and its related comorbidities (e.g., diabetes ...

Murine Vertical Sleeve Gastrectomy: A Surgical Procedure to Downsize Stomach in Experimental Mouse Models

Source: Garibay, D., Cummings, B. P. <a href="https://www.jove.com/video/56534" target="_blank">A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, a vertical sleeve gastrectomy procedure is performed on an experimental mouse model. This procedure helps remove a significant portion of the stomach along its greater curvature.

Gastrectomie verticale murine : une intervention chirurgicale pour réduire la taille de l’estomac dans des modèles murins expérimentaux

Source: Garibay, D., Cummings, B. P. A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy. J. Vis. Exp. (2017)
In this video, a vertical sleeve gastrectomy ...

Un modèle murin de gastrectomie verticale

Résumé

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