Name: a murine model of vertical sleeve gastrectomy
Uploaded: 2017-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
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Questa ricerca è stata sostenuta da R21CA195002 di NIH/NCI-01A1, del Consiglio del Presidente delle donne di Cornell e la diversità di Istituto europeo di oncologia SUNY. Laboratorio Dr. Cummings' anche ha ricevuto finanziamenti per il periodo di progetto dal programma di formazione comparativa biologia cancro Cornell ed Eli Lilly and Company.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso e Cornell University istituzionale Animal Care.
1. preparazione pre-chirurgica
Nota: Studio topi sono in genere su un fondo C57BL indotta da dieta obeso per rendere gli studi traduzionalmente pertinenti per insulino-resistenza e l'obesità umana. Topi maschi e femmine possono essere studiati come descritto nei passaggi successivi.
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	<li>Ad un'età di 2 mesi, posto topi su una dieta grassa alta 45% o 60% per 2 mesi (Vedi Tabella materiali). Nota: I topi sono alimentati una dieta grassa alta per creare un fenotipo obeso e insulino-resistente. Brevi o lunghi periodi di dieta grassa alta alimentazione possono essere utilizzati a seconda degli obiettivi dello studio.</li>
	<li>Continuare ad alimentare topi ad libitum fino alla chirurgia. Se sono necessarie misurazioni di base, dopo 7 settimane di alto contenuto di grassi dieta alimentazione, veloce topi per 6 ore o durante la notte e prendere un campione di sangue della linea di base per la misurazione dei metaboliti di interesse (ad es., glucosio).</li>
	<li>Continuare a topi su alto contenuto di grassi dieta e consentono topi una settimana per recuperare dopo il prelievo di sangue prima dell'intervento chirurgico sham o VSG. Posizionare il mouse su un liquido dieta (Vedi Tabella materiali) per 4 giorni prima dell'intervento chirurgico. Nota: I topi sono mantenuti su una dieta liquida prima e dopo chirurgia per cancellare l'apparato digerente del particolato che può compromettere la risposta di guarigione.</li>
	<li>Sterilizzare i seguenti elementi prima dell'intervento chirurgico: lamina, garza, cotone punta applicatori (CTA) e gli strumenti chirurgici (pinza emostatica, operativo a forbice, forbice iris, pinza dumont, Seghettato pinza Adson Brown, ago sonda gastrica, microneedle driver, forbici di primavera ).</li>
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2. verticale Sleeve Gastrectomy e Sham procedure
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	<li>Il giorno dell'intervento pesare topi per ottenere una misurazione di peso di base.</li>
	<li>Attrezzare la sala chirurgica con un sistema di anestesia, bagno di acqua riscaldata e rilievo di riscaldamento. Impostare il bagno di acqua a 37 ° C e utilizzarlo per riscaldare la soluzione salina allo 0,9% per l'irrigazione. Pulire il campo chirurgico con etanolo al 70% e utilizzare una tecnica sterile per aprire strumenti e chirurgia autoclavato pack. Nota: Il dissipatore di calore viene utilizzato per mantenere l'animale caldo durante l'ambulatorio ed il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Utilizzando una camera di induzione, anestetizzare il mouse con isoflurano 5% e il tasso di flusso di2 O di 1 L/min verificare che il mouse sia nel piano appropriato di anestesia eseguendo un pizzico di punta. Mantenere il mouse con isoflurane 1-3% e un tasso di flusso di2 O di 0,6 L/min una volta raggiunta un coerenza piano di anestesia.</li>
	<li>Una volta che il mouse è anestetizzato, posto unguento oculare (Vedi tabella materiali) sui suoi occhi per tenerli umidi durante la chirurgia. In questo momento anche amministrare un analgesico, come meloxicam (2 mg/kg per via sottocutanea). Tagliare i capelli dal umbilicus axilla premuto delicatamente la pelle per fornire tensione.
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		<li>Come la pelle del mouse è sottile e delicata, fare attenzione a non causare lesioni cutanee quando i capelli di ritaglio. Pulire la pelle con alcool e povidone-iodio.</li>
		<li>Indossare guanti sterili e preparare il campo operatorio sterile e strumenti. Eseguire il resto della procedura utilizzando una tecnica sterile. Preparare il campo operatorio sterile mettendo teli chirurgici sterili su entrambi i lati del mouse. Utilizzare in autoclave stagnola per creare un telo chirurgico per il mouse.</li>
		<li>Tagliare un piccolo foro nella carta stagnola per consentire l'accesso all'addome del mouse.</li>
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	<li>Praticare un'incisione della pelle dall'addome metà (ombelico) al livello della cartilagine xifoide utilizzando una forbice di iris. Identificare la linea alba e uso iris forbici per tagliare attraverso la parete del corpo lungo la linea alba. Utilizzare inviti all'azione per elevare delicatamente lo stomaco fuori l'addome e poi senza mezzi termini sezionava il maggior omento al largo di maggior curvatura dello stomaco.</li>
	<li>Legare l'arteria gastrica breve che corre tra il fondo dello stomaco e la milza inserendo due legature con sutura assorbibile monofilamento di 7-0. Usare le forbici di primavera per tagliare tra le due legature. Una volta che l'arteria è attraversata, esternare completamente lo stomaco dalla cavità addominale. Posizionare la garza sotto lo stomaco e bagnato con soluzione fisiologica per mantenere il tessuto umido.</li>
	<li>Procedura Sham
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		<li>Per la procedura di sham, posizionare un modello continuo semplice sciolto della sutura utilizzando filo di sutura assorbibile monofilamento 6-0 con un ago conico. Iniziare 2 mm verso destra (destra del chirurgo) dell'esofago. Posizionare la linea di sutura lungo la parete gastrica ventrale e poi proseguire lungo la dorsale parete gastrica. Nota: Per tutte le manipolazioni gastriche, utilizzare solo filo di sutura monofilamento assorbibile per diminuire il rischio di infezione. Inoltre, utilizzare solo sutura con un ago conico per tutte le manipolazioni gastriche, come uso di un ago di taglio aumenta il rischio di sutura "tirare-attraverso" che conducono al danno di tessuto gastrico e deiscenza della ferita.</li>
		<li>Passare l'ago completamente attraverso una parete gastrica pur ponendo la sutura. Assicurarsi che la sutura è disteso, ma non limitando lo stomaco. Delicatamente legare la sutura fuori usando 3-4 tiri e passare al punto 2.9.</li>
		<li>Per la procedura VSG saltare punto 2.7 e procedere con passo 2.8.</li>
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	<li>Procedura di VSG
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		<li>Per la procedura VSG, legare i rami prominenti dell'arteria gastrica e della vena con 7-0 il suturare assorbibile monofilamento con un ago conico utilizzando 3 genera per ogni nodo. Posizionare le legature appena sotto (cioè, verso poca curvatura dello stomaco) la linea prevista del transection. Nota: La linea prevista del transection inizia ~ 2 mm sopra (significato verso la grande curvatura dello stomaco) la tacca cardiaca dello stomaco e almeno 2 mm sotto la pilcatus di margo e si estende all'estremità prossimale del lobo di destra del pancreas. In genere, ci sono 4 vasi a parete gastrica che hanno bisogno di essere legato; Tuttavia, questo può variare fra i topi.</li>
		<li>Per evitare la fuoriuscita del contenuto gastrico durante la gastrectomia, posizionare una semplice linea continua di sutura passando attraverso entrambe le pareti gastriche appena sotto la linea prevista del transection utilizzando filo di sutura assorbibile monofilamento 6-0 con un ago conico. Iniziare la linea di sutura a destra del chirurgo dell'esofago e sotto il margo pilcatus e fine appena sopra il pancreas.</li>
		<li>Posto con punta sottile emostatiche sopra la linea di sutura e primavera forbici per tagliare tra la linea di sutura ed emostatiche. Rimuovere il tessuto gastrico transected dal campo operatorio sterile.</li></ol></li></ol>Utilizzare inviti all'azione per pulire sangue e digesta fuori lo stomaco.
		<li>Rafforzare l'apposizione delle pareti gastriche con sutura assorbibile monofilamento di 6-0 con un ago conico utilizzando un semplice modello discontinuo. Nota: Un modello di semplice sutura discontinuo è consigliato poiché questo fornisce una chiusura più sicura rispetto al modello semplice sutura continua.</li>
		<li>Lavare il residuo gastrico con soluzione salina durante l'intera procedura al fine di mantenere il tessuto umido e pulito. Usare un ago di sonda gastrica 20G collegato ad una siringa 20 mL per eseguire lavanda gastrica con soluzione fisiologica. Utilizzare questo formato per garantire un'adeguata pressione viene fornita senza rischio di danno di tessuto gastrico da una pressione eccessiva o danno accidentale tessuto gastrico dall'uso di un ago aguzzo regolare.</li>
		<li>Utilizzare un minimo di 20 nodi per chiudere saldamente lo stomaco; prestare attenzione alla chiusura lungo il lato dell'esofago, in quanto questo lato è più difficile accedere e quindi è spesso un sito di deiscenza.</li>
		<li>Assicurarsi che non vi siano perdite premendo delicatamente sullo stomaco con inviti all'azione. Se le perdite sono identificate, inserire ulteriori nodi semplici discontinui sulle aree di perdita e quindi le fughe nuovamente. Prova di tenuta finché non viene rilevata nessuna perdita.</li>
		<li>Fare un lavaggio approfondito finale dello stomaco con almeno 60 mL di soluzione fisiologica per garantire che nessun particelle infettive è stato lasciato alle spalle.</li>
	
	
	<li>Rimettere lo stomaco nella cavità addominale sotto il fegato utilizzando un CTA. Posto CTAs lungo la funzione dorsale della cavità addominale per assorbire tutto il liquido in eccesso. Utilizzando un ago 18G, iniettare la soluzione di Ringer lattato (LRS) con o senza antibiotici (0,5 mL LRS + /-20 mg/kg di enrofloxacina) direttamente nella cavità addominale, appena prima della chiusura. Nota: Questo sostituisce con esperienza durante la chirurgia di perdita di liquidi e fornisce un metodo per l'applicazione diretta di antibiotici al sito chirurgico assistere con il recupero.</li>
	<li>Chiudere lo strato del muscolo addominale utilizzando filo di sutura assorbibile monofilamento 6-0 con un ago conico in un semplice modello discontinuo. Quindi chiudere lo strato della pelle con sutura assorbibile monofilamento di 6-0 in un semplice modello di continuo.</li>
	<li>Posizionare l'adesivo del tessuto sulla pelle e piegare la pelle sopra la linea di sutura per seppellire la sutura in modo che il mouse non può interferire con la chiusura della ferita postoperatorio.</li>
	<li>Spegnere l'isoflurano e lasciare il mouse recuperare il termocuscino per 10-15 minbefore restituirlo alla sua gabbia a casa. Non lasciare l'animale incustodito finché ha ripreso conoscenza e si è in grado di muoversi.</li>
	<li>Tenere gli animali ospitati singolarmente fino a completa guarigione dall'intervento chirurgico. Nota: Se cibo accurata aspirazione misure sono ottenibili in tutto studio, topi dovrebbero continuare a essere alloggiati singolarmente in tutto Studio. C'è un rischio di ostruzione di corpo estraneo da mangiare biancheria casa gabbia. Gli animali dovrebbero essere alloggiati in gabbie gratuite della biancheria da letto tranne per materiale per fornire un arricchimento di incastramento (Vedi Tabella materiali).</li>

3. misurazioni e cura del Mouse post-operatorio
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	<li>Tornare il mouse alla sua gabbia a casa e posizionare la gabbia su un rilievo di riscaldamento. Mantenere topi una dieta liquida per almeno 7 giorni dopo la chirurgia. Amministrare un analgesico, come meloxicam (2 mg/kg per via sottocutanea), per 2 giorni dopo la chirurgia. Nota: Si può somministrare un antibiotico, come enrofloxacina (20 mg/kg), fino a 7 giorni dopo la chirurgia. Gli antibiotici sono indicati per minimizzare il rischio di infezione dalla procedura chirurgica e possono o potrebbero non essere necessari a seconda del livello di sterilità mantenuto durante tutta la procedura. Tuttavia, se gli antibiotici sono usati, deve essere somministrati a topi tutti nello stesso studio per mantenere la coerenza.</li>
	<li>Durante il periodo post-operatorio valutare il peso corporeo, assunzione di cibo, defecazione, livello di attività e la disposizione almeno ogni giorno per garantire la corretta guarigione e recupero. Effettuare il monitoraggio post-operatorio per 14 giorni dopo l'intervento chirurgico. Nota: Guasto chirurgico è in genere visto immediatamente dopo chirurgia o entro tre giorni post-operativamente. Animali che sono non mangiando o bevendo il secondo giorno dopo l'intervento chirurgico devono essere attentamente monitorati per le complicazioni chirurgiche.</li>
	<li>Dopo il completamento del periodo post-operatorio, misurare l'ingestione di cibo e di peso di corpo regolarmente nel corso di studio per garantire il mantenimento del fenotipo appropriato.</li>
	<li>Eseguire un test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) per valutare la tolleranza al glucosio, secrezione insulinica glucosio-mediata e svuotare la secrezione dell'ormone.
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		<li>Eseguire l'OGTT in topi dopo il digiuno per 6 ore e poi topi sonda gastrica con soluzione di destrosio 50% ad una dose di 1 g/kg.</li>
		<li>Raccogliere i campioni di sangue di coda a 0, 2,5, 5, 15, 30, 60 e 120 minuti dopo il gavage. Misurare la glicemia con un glucometro questi intervalli di tempo. Raccogliere i campioni di siero in ogni momento per la misura di vari ormoni come l'insulina e GLP-1.</li>
		<li>Topi veloci per 6 h prima dell'eutanasia. Prendere una misura del glucosio e del campione di sangue finale. Confrontare la misura finale del glucosio per la misurazione di base. Eutanasia topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital ad una dose di 200 mg/kg.</li>
		<li>Utilizzare la linea di base ed i campioni di siero finale per misurare analiti aggiuntivi e confrontare i valori chirurgici pre- e post-operatori.</li>
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, tranne Dr. Cummings ha ricevuto finanziamenti da Eli Lilly e Company.

Chirurgia bariatrica è il trattamento più efficace a lungo termine per l'obesità e si traduce in benefici per la salute quali elevati tassi di tipo 2 diabete e ipertensione remissione1,9,15. Modelli murini di chirurgia bariatrica forniscono un potente strumento con cui identificare i meccanismi da cui l'ambulatorio bariatric causa miglioramenti rapidi e pronunciati in comorbilità dell'obesità. Inoltre, modelli murini della ...

Come l'epidemia di obesità continua a crescere in tutto il mondo chirurgia bariatrica ha guadagnato popolarità come è il trattamento più efficace a lungo termine per l'obesità1. Purtroppo, perdita di peso di dieta ed esercizio fisico è difficile da raggiungere e relativamente inefficace sopra il lungo termine2,3. Chirurgia bariatrica, come la gastrectomia verticale (VSG), è definita come la manipolazione del tratto gastrointestinale allo scopo di peso perdita1,4. Anche se la perdita di peso è un importante risultato della chirurgia bariatrica, la chirurgia bariatrica fornisce altri benefici per la salute come migliorare comorbidities obesità ed estendere la durata della vita5. Ad esempio, chirurgia bariatrica comporta elevati tassi di remissione del diabete di tipo 2 e ipertensione e le riduzioni del rischio di vita dello sviluppo di alcuni tipi di cancro1,6,7. Di nota, l'effetto della chirurgia bariatrica causando remissione del diabete di tipo 2 e ipertensione è spesso osservato subito dopo intervento chirurgico e prima di peso perdita8,9. Questo mette in evidenza il concetto che ci sono meccanismi indipendenti di peso corporeo contribuendo a benefici per la salute osservati dopo la chirurgia. Modelli animali di chirurgia bariatrica sono state sviluppate e sono utilizzate per studiare i meccanismi da cui questi benefici per la salute si presentano10,11,12.
Abbiamo convalidato un modello murino di VSG, che abbiamo applicato ai vari modelli di topi geneticamente modificati per studiare i meccanismi con cui la chirurgia bariatrica migliora comorbidities obesità come il diabete di tipo 2, ipertensione e cancro colorettale10 , 11 , 12. modelli roditore permettono il controllo più sperimentale e la capacità di eseguire manipolazioni genetiche o farmaceutici per definire il ruolo di specifici geni o vie di segnalazione di interesse. Ci stiamo concentrando principalmente sulla VSG perché VSG è la procedura bariatrica più comunemente effettuata nella clinica nei Stati Uniti13. Inoltre, VSG è un semplice modello chirurgico con meno modifiche anatomiche rispetto ad altre procedure quali deviazione di bypass o biliopancreatic gastrico Roux-en-Y.
Il nostro modello del topo del VSG ricapitola i seguenti effetti della chirurgia bariatrica osservata in esseri umani: perdita di peso, ridotto apporto di cibo, regolamento migliore del glucosio, ha migliorato la funzione dell'isolotto, aumentata secrezione postprandiale glucagone-like peptide-1 (GLP-1), ha ridotto la pressione arteriosa e una maggiore circolazione dell'acido di bile concentrazioni10,11,12,13,14,15. Pertanto, questo è un modello ideale per studiare i corpo peso dipendenti ed indipendenti meccanismi mediante il quale VSG migliora o risolve i comorbidities obesità. Inoltre, è un modello affidabile che può essere combinato con altre procedure chirurgiche, che consente per l'indagine dell'impatto del VSG in varie condizioni di malattia con maggiore comprensione meccanicistica12.

<table><tbody><tr><td>45% high fat diet</td><td>Research Diets</td><td>D12451</td><td></td></tr><tr><td>60% high fat diet</td><td>Research Diets</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Boost</td><td>Nestle</td><td>160-67538</td><td>rich chocolate flavor</td></tr><tr><td>6-0 Suture</td><td>Ethicon</td><td>Z432</td><td>monofilament absorbable/taper</td></tr><tr><td>7-0 Suture</td><td>Covidien</td><td>8866127-01</td><td>monofilament absorbable/taper</td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-118</td><td>small</td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>233-400-101</td><td>large</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Various</td><td></td><td>4x4 4 ply and 2x2 4 ply</td></tr><tr><td>Foil</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery drape</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LRS</td><td>Hospira</td><td>170RX</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye Ointment</td><td>Paralube&amp;reg; Vet Ointment</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>141-213</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Enrofloxacin</td><td>Baytril</td><td>08713254-186599</td><td>22.7 mg/ml</td></tr><tr><td>Thin tipped hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14018-18</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forcep</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Serrated Forcep</td><td>Fine Science Tools</td><td>11020-12</td><td></td></tr><tr><td>Gavage needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>18060-20</td><td></td></tr><tr><td>Microneedle driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-14</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL syringe</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20mL syringe</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucometer (one touch ultra mini)</td><td>Lifescan</td><td>70021208</td><td></td></tr><tr><td>Multiplex insulin and GLP-1 kit</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>K15171C-1</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.00</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td></td></tr></tbody></table>

a murine model of vertical sleeve gastrectomy

Chirurgia bariatrica, come la gastrectomia verticale (VSG), è un intervento chirurgico del tratto gastrointestinale che viene eseguito ai fini della perdita di peso. Chirurgia bariatrica è attualmente il trattamento più efficace a lungo termine per l'obesità. Oltre alla perdita di peso, la chirurgia bariatrica produce benefici per la salute supplementari come la remissione del diabete di tipo 2, remissione di ipertensione e diminuzione del rischio di sviluppare alcuni tipi di cancro. I meccanismi di là di perdita di peso per questi benefici rimangono in modo incompleto definiti. Pertanto, modelli animali di chirurgia bariatrica sono essere sviluppato e validato per identificare i meccanismi che portano a questi benefici, con l'obiettivo di migliorare la comprensione della fisiologia gastrointestinale e identificare nuovi bersagli terapeutici. VSG è diventata la procedura bariatrica più comunemente effettuata nella clinica negli Stati Uniti perché è altamente efficace nel produrre la perdita di peso e miglioramento metabolico ed è più semplice da eseguire rispetto altre procedure bariatriche. Di conseguenza, abbiamo sviluppato e validato un modello murino di VSG. Questo modello murino di VSG ricapitola molti degli effetti di VSG visto negli esseri umani, compreso il regolamento del glucosio e pressione sanguigna migliorata. Il metodo si basa sull'isolamento dello stomaco, la legatura dei vasi gastrici e rimozione del 70% dello stomaco transecting lungo la maggior curvatura dello stomaco. Abbiamo applicato con successo questo protocollo chirurgico con varie linee di topi geneticamente modificati per definire i contributori meccanicistici ai benefici del VSG. Inoltre, questo modello murino di VSG è stato combinato con altre tecniche chirurgiche, per raggiungere la più profonda comprensione meccanicistica. Pertanto, questo è un modello semplice e versatile per lo studio della fisiologia gastrointestinale e benefici per la salute della chirurgia bariatrica.

La farsa e VSG procedure sono illustrate nella Figura 1. Figura 1A Mostra dove la linea di sutura è posizionata lungo le pareti gastriche durante la procedura di sham. Questa stessa area è dove lo stomaco viene tagliato durante l'intervento chirurgico VSG. Figura 1B Mostra il residuo tubolare della sinistra di stomaco dopo la performance di VSG.
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A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Quanto segue descrive le prestazioni della gastrectomia verticale nei topi. Si tratta di un tipo di chirurgia di perdita di peso che comporta l'asportazione di circa il 70% dello stomaco.

Un modello murino di gastrectomia verticale

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.1K Views.  Cornell University. Quanto segue descrive le prestazioni della gastrectomia verticale nei topi. Si tratta di un tipo di chirurgia di perdita di peso che comporta l'asportazione di circa il 70% dello stomaco.

Video: A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Murine Pancreatic Islet Isolation

Hi, I am Greg Zott. I'm with the UCSF Diabetes Center in the Bluestone Laboratory, and today I'm gonna show you the process for isolating mouse eyelets. The procedure involves the injection of a collagenase solution into the pancreas of a C3 H donor mouse, where we will then remove that pancreas, digest it away, purify the eyelets on a fial gradient, and then handpick them for ultimate transplant into the kidney capsule of a diabetic NOD mouse, Which will be our recipient.Before we start this procedure, we diluted our ATE solution in a modified Hanks buffer and we have adjusted the concentration specific for the strain of mouse that we're using the C3 H.We found digests better at a 0.8 mgs per mil collagenase solution, and we will use that to inject into the common bile duct to distend the pancreas.Performing. The procedure today Will be Pavo codre of the diabetes center. He will inject, open up the mouse, expose the the intestines, and then inject into the common bile duct.We will spray down the mouse with ethanol to keep the hair down, and then we will also verify that the mouse has been sacrificed properly with a toe pinch. Pavo will now open up the mouse and exposing the intestine and the pancreas with a midline incision. The diaphragm will also be cut to verify that the mouse will be sacrificed.Before we get started, I'd like to point out some of the important structures. The stomach is lying right here with the pancreas attached underneath into the duodenum and above. This is the liver where we'll find the gallbladder and the common bile duct, which you can see right here.So what Pavo will do next is he will isolate the small intestine, find where the common bile duct enters the small intestine. Once the intestine is exposed, we clamp on either side of the common bile duct with mosquito clamps. We find that this allows more collagenates to enter the pancreas while other groups try to direct the clamp on top of the common bile duct.We find that this is a better technique in allowing enzyme to enter the pancreas. This is a gentle procedure. You don't want to tear the bowel.You wanna allow the clamps to lie gently on either side of the common bile duct. Now we will find a gallbladder, and once the gallbladder's exposed, we will use that as a guide to injecting the collagenase into the common bile duct. Powell's using a 30 gauge needle with a five cc syringe containing three mills of collagenase solution.As he's entering the common bile duct, he's distending that duct with collagenase solution and then he travels down the common bile duct till he reaches near the intestine. And as he's going down, the enzyme solutions being pumped into the injected into the pancreas. Now that the pancreas is inflated with collagenase solution, Powell's gonna remove the hemostats and then remove the pancreas from the the mouse carefully tearing it away from the intestine.He removes it from the stomach. Okay, and then using the spleen as a handle, he lifts up the pancreas and then slowly snips it away in the common bile duct, and that's it. Pancreas is laid out and then the spleen is removed, and there he's removing the meso enteric tissue, and then the pancreas is placed in a two mill collagenase solution and a sterilized glass vial and it's placed back on Ice.The isolated pancreas that we put into the glass vials will now be placed into a 37 degree water bath for approximately 17 minutes. We placed them into a 50 mil conical rack so that they don't float up. Once during the bath, the timer starts and the digestion begins.Once the digestion time is completed, vials are removed, and then they are shaken and disrupted gently. And once the tissue starts falling apart, the vial is then placed on ice. A sterile screen is placed over a 400 mil beaker that contains washing buffer.The pancreas digest is then carefully poured over the screen into the wash buffer. For demonstration purposes, the hood has been turned off and the glass of the hood has been raised so we could see what we're doing. Once the pancreas digest is poured into the beaker, the vials are rinsed with the same washing buffer and the wash buffer placed over the screen.We have a syringe filled with washing buffer. We will use that to forcefully wash the tissue through the screen. The idea is to release any loose eyelets that are unattached to the matrix, but leaving the membranes and the undigested tissue on the screen.And when you're finished washing a tissue, this is what you usually See at the end of the procedure. The Pancreas tissue that's in the bottom of the tube will now be transferred to two 50 mil conical, and the tissue will be washed, the tissue's mixed evenly, and then distributed evenly so that we have a equal pellet volume in each tube. The beaker is now rinsed with more washing buffer.The sides are rinse so that you get all tissue that is entered the beaker again. Then it's equally distributed between each two, both 50 mil. Conical then are topped off with wash buffer.The tissue is inverted several times and then placed into a centrifuge. This is a quick spin. The centrifuge is allowed to reach a thousand RPM and then is turned off.The tissue at this time is very S eyelets are very sensitive, and you don't want to over compact them. The tubes are removed and we will do this wash step three more times. This is the end of the third wash.The components of the 50 mil conical tube are transferred to the 15 conical tube and centrifuge for a thousand RP M and then stopped. The supernat will be removed and the first part of the FI Call will be started. We are at the step where we Have our pelleted di pancreas digest.We'll resuspend that tissue so it's nice and loose to the pellets. We'll add the first density gradient, which is 1 1 0 8. We'll add five mils to each tube.The pellet is then mixed thoroughly in each of the gradients. It's important that you get good tissue distribution in your heaviest gradient. Now we will layer two mils of 1 0 9 6 density.We will then on top of that, layer two mils of 1 0 6 9 density, and then on top of that 1 0 3 7 density. It's important while you're layering the densities that you don't mix. Then all the layers have been added to the tube.And you can see this is the top of 1 1 0 8, the top of 9 1 0 9 6, the top of 1 0 6 9 and the top of 1 0 3 7. And you could see the tissue is already starting to move to its proper density even without centri fusion. The fial gradients are brought up to speed at 1800 RPM for 15 minutes, and remember to keep the brake off after the tubes are removed from the centrifuge.You can see between the 0 0 9 6 and 0 0 7 layer, there's a nice band of eyelet tissue Pablo's. Now removing the 0 3 7 layer to remove any tissue debris and DNA that might have been released during the processing. Using a sterile plastic pasture pipette, he will now remove the islet layer and transfer them to a 50 mil conical containing 25 mils of wash buffer.You want do this step quickly because fol is toxic to eyelets. We actually removed the entire 0 6 9 and 0 9 6 layer. Pavo cuts the top of the plastic pasture pipette and rinses it with wash buffer.The eyelets are then centrifuge like we centrifuge previously. Centrifuge is brought up to a Thousand RPM and then we stop it and We aspirate off. The supernatant eyelets will be washed three times with wash media.So we just completed the eyelid Isolation process we took from the digest to the fol gradient to the purified eyelets after our third wash with wash buffer, we resuspended the eyelets in our RPMI media and we played it in a tissue culture plate. These eyelets are now ready for in vitro assays or in vivo preps like eyelet Transplant.

Murino pancreatica isolamento Islet

Ricerca

Biologia

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modello murino di ischemia degli arti posteriori

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murino procedura trapianto renale

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Modello murino per la malattia di Parkinson: da 6-OH lesione dopamina a test comportamentali

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD-Legatura: un modello murino di infarto miocardico

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Techniques of Sleeve Gastrectomy and Modified Roux-en-Y Gastric Bypass in Mice

Obesity is a major public health issue, with a prevalence of 4 to 28% for men and 6.2 to 36.5% for women in Europe (from 2003 to 2008). Morbid obesity is frequently associated with metabolic complications, such as type 2 diabetes, hypertension, and dyslipidemia, reducing life expectancy and quality. In the absence of any effective noninvasive treatments, bariatric surgery is a valuable therapeutic option for patients with morbid obesity (body mass index (BMI) &#62;40 kg/m2), leading to long-term, sustained weight loss and improvements in metabolic complications. However, the underlying cellular and molecular mechanisms sustaining the beneficial effects of bariatric surgery are not yet fully understood. Due to the numerous genetically-modified strains available, the mouse model is the most convenient animal model to explore the molecular mechanisms behind the pleiotropic beneficial effects of bariatric surgeries. Here, we detailed the optimized healthcare methods and surgical protocols in mice for the two most widely-used bariatric surgeries: the sleeve gastrectomy and the modified Roux-en-Y gastric bypass. Deciphering the molecular mechanisms underlying the therapeutic effects of bariatric surgeries offers the promise of identifying new therapeutics targets.

Bariatric surgery is the most efficient way to reduce body weight and the deadly metabolic complications (diabetes, obesity, and dyslipidemia) frequently associated with morbid obesity. Mouse models of bariatric surgery represent a unique asset for deciphering molecular mechanisms behind the beneficial effects of these surgeries on diabetes, hypertension, and dyslipidemia.

Tecniche di sleeve gastrectomy e modificata Roux-en-Y bypass gastrico nei topi

Obesity is a major public health issue, with a prevalence of 4 to 28% for men and 6.2 to 36.5% for women in Europe (from 2003 to 2008). Morbid obesity is ...

Medicina

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the increased universal phenomenon of type 2 diabetes (T2D) and other metabolic problems. Bariatric surgery, such as SG, is currently one of the most effective and commonly used long-term treatment for obesity and T2D, but the association between them is not completely explored yet. The mechanisms underlying the outcomes seen after bariatric surgery in humans can be investigated based on preclinical animal studies. The SG reduces body weight, glucose levels and many metabolic parameters, and is easy to perform with a low incidence of complications. The goal of this work is to provide a simple method and an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery in animals for researchers.

The prevalence of diabetes and obesity is continuously increasing worldwide. The mechanisms between diabetes, obesity and their associated mortality and co-morbidities need to be further investigated. Here, we present a protocol for sleeve gastrectomy (SG) in animals as an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery.

Gastrectomia a maniche nei topi con clip chirurgiche

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the ...

Single-Anastomosis Duodeno-Ileal Bypass with Sleeve Gastrectomy Model in Mice

Obesity is a major health issue worldwide. As a response, bariatric surgeries have emerged to treat obesity and its related comorbidities (e.g., diabetes mellitus, dyslipidemia, non-alcoholic steatohepatitis, cardiovascular events, and cancers) through restrictive and malabsorptive mechanisms. Understanding the mechanisms by which these procedures allow such improvements often require their transposition into animals, especially in mice, because of the ease of generating genetically modified animals. Recently, the single-anastomosis duodeno-ileal bypass with sleeve gastrectomy (SADI-S) has emerged as a procedure that uses both restrictive and malabsorptive effects, which is being used as an alternative to gastric bypass in case of major obesity. Thus far, this procedure has been associated with strong metabolic improvements, which has led to a marked increase in its use in daily clinical practice. However, the mechanisms underlying these metabolic effects have been poorly studied as a result of a lack of animal models. In this article, we present a reliable and reproducible model of SADI-S in mice, with a special focus on perioperative management. The description and use of this new rodent model will be helpful for the scientific community to better understand the molecular, metabolic, and structural changes induced by the SADI-S and to better define the surgical indications for clinical practice.

Single-anastomosis duodeno-ileal bypass (SADI-S) is an emerging bariatric procedure with important metabolic effects. In this article, we present a reliable and reproducible model of SADI-S in mice.

Bypass duodeno-ileale a singola anastomosi con modello di gastrectomia a manica nei topi

Obesity is a major health issue worldwide. As a response, bariatric surgeries have emerged to treat obesity and its related comorbidities (e.g., diabetes ...

Murine Vertical Sleeve Gastrectomy: A Surgical Procedure to Downsize Stomach in Experimental Mouse Models

Source: Garibay, D., Cummings, B. P. <a href="https://www.jove.com/video/56534" target="_blank">A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, a vertical sleeve gastrectomy procedure is performed on an experimental mouse model. This procedure helps remove a significant portion of the stomach along its greater curvature.

Gastrectomia a manica verticale murina: una procedura chirurgica per ridimensionare lo stomaco in modelli murini sperimentali

Source: Garibay, D., Cummings, B. P. A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy. J. Vis. Exp. (2017)
In this video, a vertical sleeve gastrectomy ...