La méthode que nous utilisons ici peut aider à emballer l’oligonucléotide avec nanotube de carbone à paroi unique, qui est un nouveau type de nanoparticule pour l’administration de médicaments. Le principal avantage de cette technique est la livraison plus efficace de médicaments oligonucléotides dans les cellules in vivo. Les implications de cette technique s’étendent à la recherche myélome multiple, parce qu’il est introduit nanoparticule pour améliorer la livraison de médicaments oligonucléotides.
Grâce à cette méthode peut fournir un aperçu du traitement du myélome multiple. Il peut également être appliqué à d’autres maladies et conjugué avec d’autres cargaisons, telles que les protéines et les petites molécules. Tout d’abord, mélangez un milligramme de nanotubes de carbone à paroi unique, cinq milligrammes d’amine DSPE-PEG 2000 et cinq millilitres d’eau stérilisée sans nucléase dans un flacon de scintillation en verre de 20 millilitres.
Sonicate le flacon dans un sonicator bain d’eau à un niveau de puissance de 90 watts pendant une heure à température ambiante. Après la sonication, centrifuger le flacon à 24 000 fois g pendant six heures. Ensuite, collecter la solution supernatant.
Ajoutez un millilitre de la solution nanotube de carbone à paroi unique à un dispositif de filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons suivi de quatre millilitres d’eau nucléase-libre stérilisée. Centrifugeuse pendant 10 minutes à 4000 fois g à température ambiante pour enlever l’excès d’amine. Ajouter 0,5 milligramme de Sulfo-LC-SPDP à 450 microlitres du nanotube de carbone à paroi unique fonctionnalisé par amine.
Ajouter ensuite 50 microlitres de 10x PBS, et incuber pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, ajoutez le mélange de réaction à un dispositif de filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodalton, suivi de quatre millilitres d’eau sans nucléase. Centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 4000 fois g à température ambiante pour enlever l’excès Sulfo-LC-SPDP.
Recueillir la solution nanotube de carbone à paroi unique Sulfo-LC-SPDP laissée dans le filtre et la diluer avec 500 microlitres de solution anti-MALAT1-Cy3 précédemment préparée. Puis incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour obtenir les meilleurs résultats de comparaison, organisez au hasard 14 souris en groupes d’essai ou de contrôle avec sept dans chaque groupe, et avec le même rapport homme-femme dans chaque groupe.
Ensuite, nettoyez le banc d’opération et stérilisez-le avec 70% d’alcool éthylique. Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer l’une des souris pour aider la veine de la queue à apparaître. Retenez la souris correctement à l’aide d’un restrainer d’injection de queue.
Injecter des cellules MM.1S-luc/mCherry dans 50 microlitres de PBS par la veine de la queue. Appuyez sur le site d’injection avec un écouvillon d’alcool pendant 30 secondes. Ensuite, marquez la souris injectée et retournez-la dans une cage propre.
Le septième jour, après l’injection de cellules MM1S, injectez 50 microlitres de PBS contenant un nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1 dans la veine arrière de la souris. Appuyez ensuite sur le site d’injection avec un écouvillon d’alcool pendant 30 secondes. Observez le saignement local sur la queue et le comportement général de la souris pendant une minute, puis retournez-le dans une cage propre.
Observez à nouveau toutes les souris injectées avant de retourner la cage sur la grille pour vous assurer que les injections sont bien tolérées. Pesez chaque souris avant la dissection. Recueillir le sang périphérique du cœur pour un test complet de dénombrement du sang effectué par une machine de compteur de cellules sanguines.
Ensuite, recueillir les tissus de la moelle osseuse, la rate, le ganglion lymphatique, les reins, et le tissu avec des métastases visibles. Extraire l’ARN et les protéines des échantillons de moelle osseuse. Fixer tous les tissus restants dans la formaline.
Après 24 heures de fixation, plonger les échantillons d’os dans une solution EDTA 0,5 molaire pendant cinq jours pour la décalcification. Plongez ensuite tous les échantillons dans de l’alcool éthylique à 75 % pour un entreposage à long terme. Les résultats de PCR de QRT ont prouvé que l’ADN gapmeR anti-MALAT1 a renversé l’expression malat1 et induit l’apoptose de manière significative dans les cellules H929 et MM.1S.
Nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1-Cy3 a été livré dans le noyau des cellules MM, et significativement supprimé le niveau endogène MALAT1 dans les cellules H929 et MM.1S. La viabilité de la cellule BMEC-1 n’a pas de différence significative après le traitement du nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1-Cy3 ou le contrôle à différents dosages et points de temps. Cela indique que la toxicité du nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1-Cy3 a une toxicité limitée et acceptable pour les cellules normales à forte dose.
Un modèle humain de souris disséminées par MM a été établi pour évaluer les effets de traitement du nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1 in vivo. Les signaux luciferon des souris dans le groupe de traitement anti-MALAT1 de nanotube de carbone à paroi unique étaient remarquablement inférieurs comparés au contrôle après 21 jours de traitement. De ces résultats, il a été conclu que le traitement anti-MALAT1 à nanotube de carbone à paroi unique par injection intraveineuse pourrait fournir efficacement les oligos anti-MALAT1 aux cellules tumorales.
Aucun effet secondaire significatif du traitement n’a été observé, indiquant que l’injection anti-MALAT1 de nanotube de carbone à paroi unique est un traitement sûr pour des souris. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la composition de molécule cellulaire influencera la livraison, l’efficacité, et l’effet thérapeutique des drogues d’oligonucléotide. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la conjugaison de protéines ou de petites molécules peuvent être réalisées afin de répondre à d’autres questions.
Comme l’utilisation de nanotubes de carbone à paroi unique pour livrer d’autres médicaments.
