Ce protocole est une technique robuste pour déterminer l’intégrité fonctionnelle des jonctions intercellulaires serrées dans un modèle cellulaire de la barrière céphalo-encéphalique humaine. Il s’agit d’un protocole simple et assez peu coûteux qui permet de calculer la perméabilité apparente dans une période de temps plus courte au lieu d’exécuter un essai cinétique plus long. Cette méthode peut également être utilisée pour déterminer l’intégrité fonctionnelle des jonctions serrées dans les cellules endothéliales du cerveau transfectées avec des nanoparticules d’ADN polymère.
Pour commencer le placage cellulaire, placez les inserts de culture tissulaire avec des membranes microporeuses dans une plaque de culture de 24 puits. Ajouter 400 microlitres de collagène de 0,15 milligramme par millilitre de type un dans chaque insert de culture tissulaire. Puis incuber pendant une heure dans un incubateur de 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone.
Rock la plaque de 24 puits doucement pour permettre même la propagation de la solution de collagène sur la membrane microporeuse dans les inserts de culture tissulaire. Après une heure, retirer la solution de collagène et laver délicatement la membrane microporeuse avec 0,4 millilitres de tampon PBS 1X. Maintenant, plaque hCMEC/D3 cellules avec une densité de 50.000 cellules par centimètre carré dans les inserts cellulaires.
Placez la plaque de 24 puits avec installation de culture tissulaire dans l’incubateur pour permettre l’attachement cellulaire et la prolifération. Incuber la plaque pendant sept jours pour permettre aux cellules d’atteindre 100% confluence. Retirez le milieu de croissance tous les deux jours et transférez 0,5 millilitres de milieu frais préchauffé dans les inserts de culture tissulaire.
Répétez la procédure de placage pour le ballonnement occidental pour déterminer les changements dans l’expression ZO-1 pour la transfection de nanoparticules d’ADN, et pour l’analyse d’ATP pour déterminer la viabilité cellulaire dans les cellules transfected. Pour déterminer la perméabilité apparente de Lucifer Yellow, chaque jour après l’ensemencement, retirez le milieu de croissance et ajoutez 1,5 millilitres de tampon de transport préchauffé au côté basolateral du puits. Maintenant, ajoutez 58,3 microlitres de solution jaune Lucifer de 20 micromolaires au côté apical de chaque insert trans-puits.
Économisez 50 microlitres de la solution pour les mesures de fluorescence. Après avoir complètement retiré le tampon PBS résiduel du côté apical, ajouter lucifer solution jaune aussi rapidement que possible pour éviter de sécher les cellules. Assurez-vous des volumes précis de lucifer solution jaune dans le côté apical.
Assurez-vous d’ajouter le même volume précis de solution Lucifer Yellow dans tous les inserts. Travaillez rapidement pour éviter de sécher les cellules. Incuber les cellules dans un shaker rotatif à 100 RPM et 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.
Retirez ensuite 30 microlitres de l’échantillon Jaune Lucifer de chaque compartiment apical. Transférer la solution Jaune Lucifer de 20 micromères et les échantillons latéraux apical dans des tubes pré-étiquetés. Diluez maintenant l’échantillon dix fois à l’aide d’un tampon de transport.
Retirez 500 microlitres de chaque compartiment basolateral et transférez l’échantillon dans des tubes pré-étiquetés. Préparez une série de normes Lucifer Jaune pour la courbe standard. Ajouter 100 microlitres de chaque échantillon apical et basolateral standard à chaque puits d’une plaque noire de 96 puits en double.
Utilisez un lecteur de microplaque de fluorescence pour mesurer l’intensité de fluorescence jaune lucifer et calculer la perméabilité apparente, telle que décrite dans le texte manuscrit. L’effet du temps de culture sur la perméabilité jaune de Lucifer a été employé pour déterminer la cinétique apparente de la formation serrée de jonction. Les valeurs apparentes de perméabilité ont considérablement diminué le septième jour par rapport au premier jour, ce qui suggère que la barrière s’est resserré.
Les valeurs apparentes de perméabilité se sont ensuite stabilisées jusqu’au jour 10. Ceci a impliqué la formation de barrière était complète et fonctionnelle, ayant pour résultat le transport paracellulaire jaune de Lucifer diminué. Le ballonnement occidental a été employé pour détecter des changements dans l’expression de la protéine serrée de jonction ZO-1 au fil du temps.
Les deux bandes représentent les deux isoformes ZO-1. L’analyse de densitométrie a indiqué que la valeur de pixel de ZO-1 a augmenté des jours trois à sept post-ensemencement, suggérant que la protéine serrée de jonction ZO-1 s’est formée continuellement des jours trois à sept. Après traitement d’épuisement de calcium le jour sept post-ensemencement, la bande de ZO-1 était presque indétectable, indiquant que ZO-1 était incapable de former en l’absence d’ions de calcium.
Comme le montrent les résultats, le ballonnement occidental de la protéine ZO-1 peut être effectué pour déterminer les changements dans le niveau d’expression des protéines de jonction serrée, complétant les données d’activité fonctionnelle à base de Lucifer Jaune. Nous avons également découvert que l’activité fonctionnelle des jonctions serrées dans les cellules endothéliales humaines de cerveau n’a pas été affectée par la transfection de nanoparticule d’ADN.
