メルケル細胞ポリマウイルス感染の最初の細胞培養モデルを発表した。このプロトコルは、真皮線維芽細胞の単離、MCPyVウイルス感染の調製、免疫蛍光染色、および蛍光シンジコダイゼーションを含む。このプロトコルは、ウイルス遺伝子の過剰発現に関連するアーチファクトを避けながら、MCPyV感染性サイクルおよび宿主細胞との相互作用を研究することを可能にする。
まず、はさみを使用して、ヒト新生児包皮の脂肪と皮下組織をトリミングします。皮膚サンプルを半分または四分の一に切ります。抗生物質抗ミコティックを補った1ミリリットル当たり10ミリグラムの組織を1ミリグラムのII NPBSに入れる。
一晩摂氏4度でインキュベートします。翌日、マイクロディスセクション鉗子を使用して、10センチメートルの皿の真皮層から表皮を慎重に分離します。得られた真皮組織を、抗生物質-アニティクスを添加したFBSフリー培地で、1ミリリットルコガナーゼ1ミリグラム当たり2ミリグラムの5ミリリットルを含む円錐管に移す。
サンプルを摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートし、周期的に4〜6時間揺れ、わずか数個の巨視組織凝集体が残るまで培養します。この後、10ミリリットルのピペットを使用してサンプル溶液を激しく10回ピペットし、真皮から単一細胞を放出する。遠心分離機を180gで5分間、上清を捨てます。
解答した細胞を添加されたDMEM培地に盛り付けます。午後遅くまたは夕方に、600万個の293TT28細胞を、補足されたDMEM培地を含む10センチメートル皿に種を付ける。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。
翌朝、細胞が約50%コンフルエントであることを確認し、66マイクロリットルのトランスフェクション試薬、12マイクログラムの再連結MCPyV単離R17B DNA、8.4マイクログラムのST発現プラスミドpMtB、および9.6マイクログラムのLT発現プラスミドpADLで細胞をトランスフェクトする。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩細胞をインキュベートします。翌日、トランスフェクトされた細胞がほぼコンフルエントである場合、細胞をトリプシン化し、15センチメートルの皿に移して継続的な拡張を行う。
その料理がほぼコンフルエントになったら、細胞を3つの新しい15センチメートルの皿に移します。これらの新しい料理がほぼコンフルエントになると、テキストプロトコルで概説されているように細胞を収穫します。室温で180gで5分間遠心分離機。
その後、上清を除去し、DPBSマグネシウムの1つのセル体積を追加します。硫酸アンモニウム25ミクロモルを加え、続いて0.5%トリトンX-100、0.1%ベンゾナーゼ、および0.1%のATP依存性ドナーゼを加える。よく混ぜて、一晩摂氏37度でインキュベートします。
翌日、氷の上で15分間冷やします。次に、0.17の塩化ナトリウムを加えます。さらに15分間氷の上で混ぜてインキュベートします。
摂氏4度で10分間、12千gの遠心分離機。上清がはっきりしない場合は、管を軽く反転し、遠心分離を繰り返します。この後、上清を新しいチューブに移します。
ペレットを塩化ナトリウムの0.8モルを補ったDPBSの1体積で再懸濁します。摂氏4度で12,000gの遠心分離機を10分間。上清がはっきりしない場合は、管を軽く反転し、遠心分離を繰り返します。
2つの上澄みと遠心分離機を摂氏4度で12,000gで再び10分間組み合わせます。次に、ピペットを使用して、テキストプロトコルで概説されているように、ピペットを使用して、iodiキサノールの勾配を薄壁の5ミリリットルポリアロマーチューブに堆積させます。調製されたイオデキサノール勾配の上に明確化されたウイルス含有上清の3ミリリットルをロードする。
SW 55 Tiローターを234,000g、摂氏16度で3.5時間遠心分離機で、加速と減速を遅くするようにしてください。超遠心分離が完了した後、シリコンチューブに12分を集める。細胞を維持および剥離した後、10ミリリットルの添加されたDMEMおよびF12培地を皿にする。
細胞溶液を15ミリリットルチューブに移します。180gで2分間遠心分離機。上清を捨て、1ミリリットル当たり20,000~40,000細胞の間の細胞密度で、補充されたDMEMおよびF12培地中の細胞を再び懸濁します。
次いで、細胞懸濁液の種子200または400マイクロリットルを、それぞれ24または96ウェルプレートの各ウェルにコラゲターゼ型IV型の1ミリグラムで補う。MCPyVビロンストックをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置いて解凍します。感染する2500〜5000細胞ごとに、イオジキサノール1マイクロリットル当たりMCPyVビリオンの10億個のウイルスゲノム相当量を追加する。
プレートの側面を軽くタップし、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。まず、PBSで4%PFAで細胞をカバースリップに10分間固定し、PBSでカバースリップを2回洗浄し、一晩摂氏4度で70%エタノールで処理して細胞を透過させます。翌日、エタノールをプローブハイドレーションバッファーに交換し、室温で60分間インキュベートしてサンプルをプレハイブリダイズします。
プレハイブリダイゼーションインキュベーション終了の30分前に、プローブハイブリダイゼーション液中のプローブを1:500希釈で希釈し、摂氏45度でインキュベートします。インキュベーションが完了すると、約10マイクロリットルの希釈プローブ混合物をカバースリップごとに顕微鏡スライドにピペットします。各カバースリップセル側をハイブリダイゼーションミックスのそれぞれの液滴の上に下に置きます。
自由な量のゴムセメントを使用して、各カバースリップの端と背面をスライドに密封します。ヒートブロックの平らな側にスライドを設定し、3分間摂氏94度に加熱します。この後、スライドを加湿したチャンバーに移し、一晩で摂氏45度でインキュベートします。
翌日は、ゴムセメントを慎重に剥がすために鉗子を使用してください。カバースリップセル側を24ウェルプレートのウェルに上げ、室温でプローブ洗浄バッファーで3回洗浄します。カバースリップを含む各ウェルに200マイクロリットルの増幅バッファーを加え、室温で30〜60分間インキュベートします。
一方、プローブを94°Cに90秒間加熱し、30分間室温に冷却することにより、別々のPCRチューブ内のプローブを認識する2つの標識されたオリゴヌクレオチドヘアピンのアニール。1:50 の希釈で、増幅バッファーにヘアピンを混ぜ合わせます。次に、12ウェルプレート蓋の開いた面にパラフィンフィルムを伸ばし、増幅反応のための表面を作る。
ピペット50〜100マイクロリットルのヘアピン混合物を、各カバースリップ用パラフィンフィルム上に。鉗子を使用して、慎重にプリ増幅溶液から各カバースリップを取り外し、乾燥するために多孔質の使い捨てワイプにエッジをタッチします。各乾燥カバースリップセル側を増幅液滴の上に下に置きます。
プレート蓋を加湿したチャンバーに移し、室温と暗闇の中で一晩インキュベートします。翌日、カバースリップを24ウェルプレートの井戸に戻します。各ウェルに1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの濃度でDAPIを含む5X SSCTを加え、室温で1時間インキュベートします。
この後、室温で5X SSCTでサンプルを2回洗浄します。洗浄したカバースリップを顕微鏡スライドに取り付け、反転蛍光顕微鏡を使用して細胞を分析し、サンプルを画像化します。本研究では、ヒト真皮線維芽細胞のほぼ均質集団が単離される。
免疫蛍光染色法は、分離したヒト皮膚細胞のほぼ100%が真皮線維芽細胞マーカー、ビメンチン、コラーゲンに対して陽性染色されているが、ヒトの包皮ケラチノサイトマーカーK14に対しては陰性であることを明らかにしている。MCPyVビリオンが生成され、勾配のコアに集中したMCPyVビリオンのバンドを視覚化した後、500マイクロリットル分数が収集され、MCPyV qPCRがピーク画分を同定するために行われる。MCPyVに感染したHDFの免疫蛍光染色画像がここに示されており、ここで、LT陽性、VP1陽性、またはLTおよびVP1陽性の両方の細胞がMCPyV感染に対して陽性であると考えられる。
細胞の30%以上がLT陽性であり、10%以上がVP1陽性である。感染細胞で複製されたMCPyVゲノムは、HCR-DNA FISHと免疫蛍光-HCR-DNA FISHの両方を使用して検出されます。HCR-DNA FISHは、複製工場に存在するMCPyV DNAの局在を明らかにしていますが、免疫蛍光-HCR-DNA FISH法は、MCPyV DNAとLTタンパク質の両方を複製センターで同時に検出することができます。
最高のウイルス感染効率を達成するためには、イオドキサノールが細胞に有毒であるため、MCPyVがマイクロリットル当たり少なくとも2 x 10〜8番目のウイルスゲノムに集中することが非常に重要です。真皮線維芽細胞のMCPyV感染後、免疫蛍光、免疫遮断、免疫作法、およびqPCRベースのアッセイを含む多くの分子生物学的分析を行うことができる。我々が述べた感染システムは、研究者が核密売やウイルス包装のようなMCPyV感染の段階を研究することを可能にする。
MCPyVはBSL-2ウイルスであるが、実験室で達成された量の病理の可能性についてはほとんど知られていない。したがって、研究者はウイルスへの暴露を避けるために予防措置を講じる必要があります。
