Мы представили первую модель клеточной культуры для полиомавирусной инфекции Меркель Cell. Протокол включает в себя изоляцию дермальных фибробластов, подготовку вирусной инфекции MCPyV, иммунофлуоресцентное окрашивание и гибридизацию флуоресцентных на месте. Этот протокол позволяет изучать инфекционный цикл MCPyV и взаимодействия с клетками-хозяинами, избегая при этом артефактов, связанных с чрезмерной экспрессией вирусных генов.
Для начала используйте ножницы для обрезки жировой и подкожной ткани от неонатальной ткани человека. Разрежьте образец кожи пополам или четвертям. Поместите ткань в 5 миллилитров по 10 миллиграмм на миллилитр дис-основанного II NPBS, дополненного антибиотико-антимикотической.
Инкубировать при 4 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день используйте миппы микродиссекции, чтобы тщательно отделить эпидермис от кожных слоев в 10-сантиметровой тарелке. Передача полученной дермальной ткани в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров по 2 миллиграмма на миллилитр коллагеназы типа IV в FBS-свободной среде, дополненной антибиотико-анитмикотической.
Инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа с периодической тряской в течение четырех-шести часов, пока не останется всего несколько макроскопических агрегатов тканей. После этого используйте 10 миллилитровую пипетку для пипетки образца раствора вверх и вниз энергично 10 раз, выпуская одиночные клетки из дермы. Центрифуга при 180 г в течение пяти минут и отбросить супернатант.
Плита диссоциированных клеток в дополненной среде DMEM. Во второй половине дня или вечером, семена 6 миллионов 293TT28 клеток в 10 сантиметров блюдо, содержащее дополнительные DMEM среды. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
На следующее утро убедитесь, что клетки примерно на 50% стекут, затем трансфицируют клетки 66 микролитров трансфектного реагента, 12 микрограммов повторно перелифицированной MCPyV изолируют R17B ДНК, 8,4 микрограмма плазмидного pMtB экспрессии ST и 9,6 микрограммов плазмидной плазминной плазмы LT. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа. На следующий день, когда трансфектируемые клетки почти стекут, попробуйте провести биопсию клеток и перенесите их в 15-сантиметровое блюдо для дальнейшего расширения.
Когда это блюдо станет почти стеченным, перенесите клетки в три новых 15-сантиметровых блюда. Когда эти новые блюда станут почти стеченными, урожай клеток, как указано в текстовом протоколе. Центрифуга при температуре 180 г при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем удалите супернатант и добавьте один объем клеток магния DPBS. Добавьте 25 микромоляных сульфатов аммония, за которыми следуют 0,5%Triton X-100, 0,1% бензоразы и 0,1% АТФ-зависимой ДНКазы. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусах по Цельсию на ночь.
На следующий день, охладить смесь на льду в течение 15 минут. Затем добавьте 0,17 тома хлорида натрия. Смешайте и инкубировать на льду еще 15 минут.
Центрифуга при 12 тысячах г при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Если супернатант не ясен, аккуратно инвертировать трубку и повторить центрифугу. После этого перенесите супернатант в новую трубку.
Повторное потребление гранул в 1 томе DPBS дополнено 0,8 родинок хлорида натрия. Центрифуга при 12 тысячах г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Если супернатант не ясен, аккуратно инвертировать трубку и повторить центрифугу.
Смешайте два супернатанта и центрифугу снова при 12 тысячах г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем используйте пипетку для депонации градиентов йодиксанаола в тонкостеные пятими миллилитровые полиалломеры, как указано в текстовом протоколе. Загрузите 3 миллилитров очищенного вирусосодержащего супернатанта поверх подготовленного градиента йодиксаноля.
Центрифуга с ротором SW 55 Ti при 234 тысячах г и при 16 градусах Цельсия в течение 3,5 часов, убедившись, что ускорение и замедление замедляются. После завершения ультрацентрифугации соберите 12 фракций в силиконовых трубках. После поддержания и отсоединения клеток, на 10 миллилитров дополненных DMEM и F12 среды к блюду.
Перенесите клеточный раствор в 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при 180 г в течение двух минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в дополнительной среде DMEM и F12 при плотности клеток от 20 тысяч до 40 тысяч клеток на миллилитр.
Затем семя 200 или 400 микролитров клеточной суспензии дополняется 1 миллиграммом на миллилитр коллагеназы типа IV в каждую колодец 24 или 96 пластин, соответственно. Удалите бульон MCPyV viron из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию и поместите на лед, чтобы оттаять. Добавьте 1 миллиард эквивалентов вирусного генома MCPyV virions на один микролитер йодиксанаола на каждые 2500-5000 инфицированных клеток.
Нажмите на сторону пластины осторожно, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Во-первых, исправить клетки на крышку скользит с 4%PFA в PBS в течение 10 минут, а затем мыть крышку скользит дважды с PBS и лечить их с 70%ethanol при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы пронизать клетки. На следующий день замените этанол буфером гидратации зонда и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут, чтобы предварительно гибридизировать образцы.
За 30 минут до окончания предмиоцифизации инкубации разбавьте зонды в раствор гибридизации зонда при разбавлении 1:500 и инкубировать при 45 градусах по Цельсию. Когда инкубации завершены, пипетка примерно 10 микролитров разбавленной смеси зонда на слайд микроскопа для каждого покрытия скольжения. Поместите каждую крышку скольжения ячейки сторону вниз на его соответствующие капли гибридизации смеси.
Используя либеральное количество резинового цемента, запечатайте края и заднюю часть каждой крышки скольжения к его слайду. Установите слайд на плоской стороне теплового блока и нагрейте их до 94 градусов по Цельсию в течение трех минут. После этого перенесите слайд в увлажненной камере и инкубировать их при 45 градусах по Цельсию в одночасье.
На следующий день используйте типсы, чтобы тщательно очистить резиновый цемент. Поместите крышку скользит клеточной стороне вверх в колодцы 24 хорошо пластины и мыть их с зондом мыть буфер три раза при комнатной температуре. Добавьте 200 микролитров буфера усиления к каждой хорошо содержащей крышку скольжения и инкубации при комнатной температуре в течение 30 до 60 минут.
Между тем, аннеал каждый из двух помечены олигонуклеотид шпильки признавая зондов в отдельных трубках ПЦР, нагревая их до 94 градусов по Цельсию в течение 90 секунд, а затем охлаждение их до комнатной температуры в течение 30 минут. Смешайте шпильки вместе в буфер усиления при разбавлении 1:50. Далее, растянуть парафин пленку над открытым лицом 12 хорошо крышкой пластины, чтобы сделать поверхность для усиления реакции.
Pipette 50-100 капель микролитров смеси шпильки на парафиновой пленке для каждого покрытия скольжения. Используя типсы, аккуратно снимите каждую крышку с раствора предварительной усиления и коснитесь края до пористой одноразовой салфетки, чтобы высохнуть. Поместите каждую высушенную крышку скольжения ячейки вниз на капельку усиления.
Перенесите крышку пластины в увлажненные камеры и инкубировать на ночь при комнатной температуре и в темноте. На следующий день, вернуть крышку скользит к колодцам 24 пластины скважины. Добавьте 5X SSCT, содержащий DAPI с концентрацией 0,5 микрограмма на миллилитр к каждой колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа.
После этого, мыть образцы дважды с 5X SSCT при комнатной температуре. Намонтируйте вымытую крышку скользит по слайдам микроскопа и используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп для анализа клеток и изображения образцов. В этом исследовании, почти однородной популяции человека дермальной фибробластов изолированы.
Иммунофлюоресцентное окрашивание показывает, что почти 100% изолированных человеческих дермальных клеток положительно окрашены дермальными фибробластными маркерами, виментином и коллагеном, но отрицательны для маркера кератиноцитов человека К14. ЗАТЕМ генерируются вирионы MCPyV, и после визуализации полосы вирионов MCPyV, сосредоточенных в ядре градиента, собирается 500 фракций микролитров и выполняется MCPyV qPCR для определения пиковых фракций. Иммунофлюоресцентные окрашенные изображения HDFs инфицированных MCPyV показаны здесь, где клетки, которые являются ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМи LT, VP1 положительные, или как LT и VP1 положительные считаются положительными для инфекции MCPyV.
Более 30% клеток являются ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМи LT, и более 10% являются положительными VP1. Геномы MCPyV, реплицируемые в инфицированных клетках, обнаруживаются как с помощью HCR-ДНК FISH, так и с помощью 60-х 300-х х 4 х 000 м. В то время как HCR-DNA FISH показывает локализацию ДНК MCPyV, присутствуют на фабрике репликации, методы Immunofluorescent-HCR-DNA FISH позволяют одновременно обнаруживать как ДНК MCPyV, так и со-локализацию белка LT в центрах репликации.
Для достижения наилучшей эффективности вирусной инфекции, очень важно, что MCPyV концентрируется, по крайней мере 2 х 10 до 8-го генома вируса на микролитер, так как иодоксанол является токсичным для клеток. После заражения MCPyV кожных фибробластов, многие молекулярные биологические анализы могут быть выполнены, в том числе иммунофторесценции, иммуно-блокирующие, иммунопозитив, и qPCR основе анализа. Инфекционная система, которую мы описали, позволяет исследователям изучать стадии заражения MCPyV, такие как ядерная торговля и вирусная упаковка.
MCPyV является вирусом BSL-2, но мало что известно о его потенциале для патологии в количествах, достигнутых в лабораторных условиях. Поэтому исследователи должны принять меры предосторожности, чтобы избежать контакта с вирусом.
