Cette expérience met en évidence la valeur thérapeutique de l’anticorps anti-c-fms dans les maladies de perturbation inflammatoire des os, telles que la polyarthrite rhumatoïde et la parodontite. Le processus par lequel la moelle osseuse est extraite et utilisée pour générer des précurseurs ostéoclastes, donne de grandes quantités d’ostéoclastes purs, qui peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval. Ce protocole fournit deux méthodes alternatives d’ostéoclastogenèse, soit en utilisant rankl ligand ou TNF alpha.
En outre, cette méthode donne un aperçu de l’effet de l’anticorps Anti-c-fms sur l’ostéoclastogenèse. La démonstration visuelle de cette procédure familiarise le chercheur avec le processus de dissection et d’obtention des cellules de moelle en grandes quantités. Pour commencer à remplir une plaque qui servira de récipient de collecte avec environ 50 millilitres d’alpha MEM, selon la taille du récipient, et le placer sur la glace.
Utilisez des broches pour percer les paumes et les pieds d’une souris euthanasié pour la fixer en position supine, et vaporiser soigneusement avec 70% d’éthanol. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et des pinces à épiler pour faire une incision cutanée au niveau de la hanche et l’étendre jusqu’aux pieds, exposant les muscles. Localiser et couper le tendon attachant le muscle quadriceps.
Peler le muscle et le couper au niveau de la hanche. Ensuite, localisez le tendon attachant le muscle ischio-jambier à l’os. Peler les muscles exposant l’os, et libérer les ischio-jambiers de son attachement, en s’assurant de ne pas couper dans l’os.
Placez les ciseaux entre la tête du fémur et l’espace commun. Coupez-y libérant le fémur, mais en gardant l’os intact, ce qui permettra le détachement des os sans risque d’exposer la moelle osseuse. Couper les muscles attachés au tibia de la même manière.
Ensuite, coupez le tibia libre de son attachement à l’articulation de la cheville, tout en gardant l’os intact pour éviter la contamination. Utilisez les lames de ciseaux et les lingettes de laboratoire pour gratter les tissus mous restants du fémur et du tibia et les placer dans la plaque préparée avec alpha MEM placé sur la glace. La dissection doit être effectuée avec soin afin de minimiser la contamination.
C’est pourquoi l’ablation approfondie des tissus mous et la localisation osseuse sont cruciales. Remplissez une seringue d’aiguille de calibre 30 avec alpha MEM. Déconnecter le tibia et le fémur de l’articulation du genou, et couper les extrémités de l’os long des deux côtés à l’aide de ciseaux.
Utilisez des pinces à épiler pour retenir l’os de l’arbre. Insérez l’aiguille dans l’espace de moelle osseuse et rincez lentement le contenu de la moelle dans un plat de culture de six centimètres et répétez pour tous les os. L’os deviendra blanc, ce qui indique l’extraction de toute la teneur en moelle osseuse.
Utilisez une passoire à cellules en nylon de 40 micromètres pour filtrer l’extrait de moelle osseuse dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube à 300 fois G pendant cinq minutes. Jeter le surnatant.
Pour laver, ajouter cinq millilitres d’alpha MEM à la pastille. Pipette les cellules pour les détacher, centrifugeuse, et répéter le lavage pour un total de deux fois. Après avoir compté ces cellules isolées, telles que décrites dans le manuscrit, grainer 10 millions de cellules par 10 millilitres, dans un plat de culture de 10 centimètres, et ajouter M-CSF aux cellules.
Incuber la culture à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. Retirer le milieu après trois jours, et laver les cellules deux fois vigoureusement avec 10 millilitres de PBS pour enlever les cellules nonherent. Ajouter cinq millilitres de température ambiante 0,02% trypsine-EDTA et PBS, et incuber à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.
Bien pipette les cellules pour les détacher. Observez la culture au microscope pour vous assurer que les cellules ont été détachées et apparaissent arrondies et flottant dans les médias. Lorsque les cellules ont été détachées, inactivez la réaction en ajoutant cinq millilitres de l’alpha MEM.
Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et une centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes. Après avoir jeté le supernatant, laver avec cinq millilitres d’alpha MEM, et centrifugeuse à nouveau à 300 fois G pendant cinq minutes. Suspendre à nouveau la pastille en 10 millilitres d’alpha MEM.
Ensemencer 1 million de cellules par 10 millilitres dans un plat de culture de 10 centimètres, et ajouter M-CSF. Incuber la culture à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. Récoltez les cellules attachées, qui représentent les MBM comme précurseurs ostéoclastes après trois jours, comme cela a été fait précédemment pendant la génération de MBM.
Ensemencer les MBM à 50 000 cellules par 200 micro litres d’alpha MEM dans une plaque de puits de 96 par puits. À chaque puits, ajouter les stimuli désirés. Et puis ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre.
Ajouter des anticorps Anti-c-fms à chaque puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant quatre jours, tout en changeant de média tous les deux jours pendant quatre jours. Et puis procéder à la coloration et les analyses, comme décrit dans le manuscrit.
La formation ostéoclaste dans la culture traitée par M-CSF et RANKL, avec l’anticorps anti-c-fms, a été évaluée. Avec 101 000 nanogrammes par anticorps anti-c-fms millilitre, une diminution significative du nombre d’ostéoclastes a été observée par rapport au contrôle. Alors que, avec un nanogramme sur 10 par millilitre anticorps Anti-c-fms, il n’y avait pas de diminution significative.
Puis, la formation ostéoclaste dans la culture alpha de M-CSF et de TNF, avec l’anticorps d’Anti-c-fms, a été évaluée. Avec 10, 100, 1000 nanogrammes par millilitre anticorps anti-c-fms, une diminution significative du nombre d’ostéoclastes a été observée par rapport au contrôle, sans diminution significative à un nanogramme par millilitre. Et la culture M-CSF avec 1, 10, 100 nanogrammes par millilitre anticorps Anti-c-fms, il n’y avait pas de diminution significative du nombre de précurseurs ostéoclastes par rapport à la lutte.
Cependant, à 1000 nanogrammes par millilitre, il y a eu une diminution significative du nombre de précurseurs ostéoclastes, ce qui indique qu’une concentration aussi élevée que 1000 nanogrammes par millilitre est nécessaire pour inhiber significativement la prolifération des précurseurs ostéoclastes. Assurez-vous de libérer les liaisons tout en gardant l’os intact, ce qui minimisera les risques de contamination.
