Dans cette étude, nous avons utilisé la classe I du CHSLD comme modèle pour résumer la méthodologie et évaluer la faisabilité d’une classe I hybride de MHC complexée de microglobuline bêta-2 héterologique. Des études antérieures ont montré que la substitution b2M des mammifères n’affecte pas significativement la présentation du peptide. En fait, la classe I hybride du MHC peut activer une structure et une fonction similaires à la molécule d’origine.
Ces techniques peuvent être utilisées pour faciliter l’étude fonctionnelle et structurée du MHC I pour l’évaluation de la réponse tissulaire pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie tumorale. Pour la transformation de la culture E.coli ajouter 10 nanogrammes de plasmide contenant des chauves-souris ou des humains MHC Classe I bêta deux chaîne d’hydrogène microglobuline à 100 microlitres de suspension égalisée et baigner la suspension dans la glace pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, la chaleur choque les bactéries pendant 90 secondes à 42 degrés Celsius et retourne la culture au bain de glace pendant deux minutes.
Ajoutez ensuite 800 microlitres de bouillon de lysogène à la culture, et secouez la suspension sur une plate-forme de basculement pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, et 200 rotations par minute. À la fin de l’incubation, étendre 100 microlitres de la bactérie sur une lame de culture résistante aux antibiotiques appropriée. Le lendemain matin, choisissez un clone bactérien récemment transformé et inoculez le clone avec trois millilitres de LB avec un milieu antibiotique.
Placez la culture sur la plate-forme de basculement à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Le lendemain matin, transférez 500 microlitres du stock bactérien activé en 50 millilitres de LB avec un milieu antibiotique, et retournez les bactéries à l’incubateur de basculement pendant la nuit. Divisez le stock bactérien activé restant en aliquots de 500 microlitres et ajoutez chaque aliquot à 500 volumes de microlitres de 40% glycérol, pour moins 80 degrés Celsius de stockage.
Pour générer de grandes quantités de protéines recombinantes, le lendemain matin transférer la suspension bactérienne en deux litres de LB avec un milieu antibiotique à un rapport d’un à 100, et retourner la culture à l’incubateur de basculement jusqu’à ce qu’une absorption de 0,6 à 600 nanomètres est atteint. Ensuite, ajoutez un millimolar IPTG à la culture pour induire l’expression du gène trans. Après quatre à six heures d’induction, transférer la culture bactérienne dans des bouteilles pour centrifugation, et suspendre à nouveau les granulés de cellules bactériennes dans 60 millilitres de PBS par bouteille.
Ensuite, libérez la protéine recombinante exprimée par perturbateur cellulaire ultrasonique 99 fois, pendant six secondes et un intervalle de 12 secondes à 300 Watts par sonication. Pour l’inclusion de purification du corps recueillir les bactéries sonicated par centrifugation et de suspendre à nouveau les granulés dans un volume approprié de tampon de lavage pour deux centrifugations supplémentaires. Après le deuxième lavage, suspendez à nouveau les corps d’inclusion et le tampon de re-suspension, et mettez de côté un aliquot de 20 microlitres de l’échantillon pour la page SDS pour tester la pureté du corps d’inclusion.
Centrifugez le reste de l’échantillon et pesez le corps d’inclusion contenant des granulés. Ajouter le tampon de dissolution aux granulés à une concentration finale de 30 milligrammes de corps d’inclusion par millilitre de tampon. Et utilisez un agitateur magnétique pour remuer lentement la solution à quatre degrés Celsius, jusqu’à ce que les organes d’inclusion soient dissous dans le tampon de dissolution.
Après avoir jeté les précipités, stockez les corps d’inclusion à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius. Pour le refolding complexe de MHC, ajoutez un glutathion réduit de cinq millimolar et un glutathion oxydé de 0,5 millimolar à 250 à 300 millilitres, un tampon de refolding de quatre degrés Celsius. Et remuer lentement la solution sur un agitateur magnétique à quatre degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes.
Pour la chaîne hydrogène MHC et la dilution bêta-deux microglobulines, chargez le corps d’inclusion dans une seringue d’un millilitre et injectez tout le volume millilitre de solution corporelle d’inclusion dans un litre de tampon de refolding près de la barre de remue-remuer, pour obtenir une dilution rapide et efficace. Ensuite, dissoudre cinq milligrammes par millilitre de peptide dans le sulphoxide diméthyle, et injecter rapidement 200 microlitres de peptide dans la solution de refolding comme vient de le démontrer. Après 10 à 20 minutes d’agitation lente, injecter trois millilitres de corps d’inclusion de la chaîne H dans un nouveau volume d’un litre de tampon de refolding et permettre au refolding de procéder à quatre degrés Celsius pendant huit à 10 heures.
Pour déterminer la concentration de protéines refolded ajouter tampon d’échange à une chambre pressurisée avec une membrane oxidase multi cuivre de 10 kilodalton, et concentrer le tampon à 30 à 50 millilitres de volume. Transférez la solution de refolding à un tube de centrifugeuse, et enlevez les précipités par centrifugation. Transférez soigneusement le superné dans la chambre et concentrez davantage le tampon sur un volume final d’environ un millilitre.
Éliminez les contaminants finaux par centrifugation et transférez le supernate dans un tube stérile. Utilisez une colonne d’exclusion de la taille de 1030 GL pour purifier les protéines, recueillir les échantillons au sommet et les analyser à l’aide de la page SDS. Recueillir le pic complexe du MHC et concentrer la protéine à une concentration finale de 15 milligrammes par millilitre.
Ensuite, diluer le complexe à 7,5 milligrammes par millilitre de concentration. Pour effectuer la cristallisation du MHC complexe et du peptide à l’aide de la technique de diffusion de vapeur de goutte assise, ajoutez 0,8 microlitres de l’échantillon à un cristal commercial et scellez la planche. Equilibrer la solution de l’échantillon contre 100 microlitres de solution de réservoir à quatre ou 18 degrés Celsius, et utiliser un microscope pour observer régulièrement la croissance du cristal au cours des six prochains mois.
Pour une protection cryogénique, à la fin de l’expérience, transférer les cristaux vers une solution de stockage contenant 20% de glycérol avant de refroidir rapidement les échantillons dans un flux d’azote gazeux Kelvin à 100 degrés. Ensuite, collectez des données de diffraction aux rayons X selon les protocoles standard. Pour déterminer la structure des complexes cristallins, ouvrez les données structurales à haute résolution de diffraction des rayons X dans le programme Denzo dans le logiciel HK L 2000, et sélectionnez un modèle initial dans la banque de données protéiques.
Pour déterminer la structure de la protéine, ouvrez les données du programme phaser MR en CCP4 et utilisez le modèle de rayons X raffiné pour le raffinement initial des articulations. Ensuite, utilisez le Phoenix affiner seul et les modes articulaires pour le raffinement des rayons X seul, et le neutron commun pour le raffinement des rayons X. Après chaque tour de raffinement, vérifiez manuellement le modèle par rapport au Fo-Fc, et 2Fo-Fc cartes de densité nucléaire positive à Coot.
Dans ces expériences représentatives, les capacités contraignantes du virus Hendra ont dérivé le peptide Hendra Virus One pour battre les chaînes d’hydrogène de classe I du MHC avec la bêta-chauve-souris homologue deux microglobuline et la bêta humaine héterologeuse deux microglobulines ont été évaluées. Dans les deux analyses, des cristaux à haute résolution ont été formés par renaturation avec la bêta deux chaîne de lumière de microglobuline. En l’absence de bêta deux microglobulines, ces complexes ne se forment pas.
Dans la chaîne hydrogène de classe I du MHC Hendra Virus un, bêta humaine deux microglobulines structure, résidus conservés H31, D53, W60, et Y63 de bêta humaine deux microglobulines, qui correspondent à la chauve-souris bêta deux microglobuline, entrer en contact avec le fond de la rainure de liaison peptidique et conservé Q8, Y10, R12, et 24 résidus, qui correspondent à la bêta deux microglobulines liées au domaine alpha trois. Dans l’ensemble des structures chauves-souris et humaines, la dérivation carrée moyenne des résidus de la racine moyenne de 1 à 184 des chaînes d’hydrogène est de 0,248 sous toutes les superpositions de l’atome alpha de carbone, ce qui indique qu’il n’y a aucune différence entre ces deux complexes. La structure de l’alignement peptidique montre que les confirmations de Hendra Virus un peptides dans ces deux complexes sont assez similaires.
L’alignement des séquences montre également que les acides aminés de la bêta deux microglobulines de différentes espèces sont fortement conservés. Il est important d’offrir à l’adversaire des complexes avec une grande efficacité de déclaration. Par conséquent, il est crucial de sélectionner la bêta appropriée deux micro globulin et d’utiliser des corps d’inclusion hautement purifiés.
Ce protocole peut être utilisé pour obtenir stable MTC I complexe grâce à la bêta potentielle deux substitutions de microglobuline chez d’autres espèces, et d’exister, ils sont MTC I structure et la fonction. Les données obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour évaluer les réponses des cellules T lors des immunothérapies infectieuses et tumorales.
