Ce protocole est approprié pour étudier la virulence de Leishmania, parce qu’il fournit une vue systémique de l’hôte vertébré à l’infection cutanée. Le principal avantage de l’adoption de ce protocole est qu’il permet aux chercheurs d’évaluer simultanément la réponse inflammatoire de l’hôte et la réplication des parasites. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser plusieurs cibles et traitements liés à la virulence, ce qui pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le contrôle cutané de la leishmaniose.
Il peut également être appliqué à d’autres souches de souris et aux espèces de Leishmania qui causent la leishmaniose cutanée. Cet essai a quelques étapes critiques, telles que exiger le personnel formé qui sont confortables travaillant avec des souris et ont l’expérience en exécutant des injections sous-plantaires pour éviter l’exposition accidentelle au matériel infectieux. Le Dr Ricardo Zampieri, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par cultiver des promastigotes L.amazonensis dans un flacon de culture cellulaire carrée de 25 centimètres, contenant 10 millilitres de pro-moyen, pendant trois jours à 25 degrés Celsius. Après l’incubation, pipette cinq millilitres de la phase de croissance logarithmique promastigote culture dans un nouveau flacon. Ajouter cinq millilitres d’ama-moyen au flacon et l’incuber à 34 degrés Celsius pendant trois à quatre jours.
Divisez la culture en la diluant à un rapport de un à trois avec l’ama-medium frais dans un nouveau flacon. Puis l’incuber pendant encore trois à cinq jours. Transférer un aliquot de la suspension axenique amastigotes diluée dans PBS à une chambre Neubauer et compter les parasites non flagellés.
Ensuite, diluer la suspension dans PBS en fonction de la dose d’inoculum désirée et le nombre d’inoculums prévus. Chargez une seringue de tuberculine avec une aiguille de calibre 27 avec la suspension parasite préparée. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée avec une pincée d’un pied et inoculer 50 microlitres de la suspension dans le tissu subplantaire sur le pied arrière gauche.
Enregistrez la progression de la lésion une fois par semaine, en mesurant l’épaisseur des pieds infectés et non infectés à l’aide d’un étrier, et calculez la différence d’épaisseur entre les deux pieds pour évaluer la progression des lésions. Ajouter un millilitre de pro-moyen dans un tube de broyeur de tissu en verre par lésion et peser le tube. Vaporiser 70% d’éthanol sur le pavé pour la désinfection et exciser le pied de l’animal à son talon pour extraire le pavé infecté.
Assurez-vous que les ciseaux et les forceps sont stérilisés en les gardant trempés dans 70 % d’éthanol. Placez le pavé dans une boîte de Pétri stérile et disséquez-le avec les forceps et le scalpel. Recueillir tous les tissus mous et jeter les os.
Transférer les tissus recueillis dans le tube de broyeur de tissu de verre et peser le tube à nouveau pour déterminer le poids de lésion. Homogénéiser le tissu 10 fois avec le broyeur pour une perturbation complète des tissus, et permettre au mélange de se peupler. Recueillir 20 microlitres du surnatant et le charger dans la première colonne et la première voie de la plaque de puits 96, préparé selon les instructions manuscrites.
Répétez cette étape pour que les trois prochaines voies aient des résultats quadruplicate pour chaque animal. Homogénéisez chaque puits 10 fois à l’aide d’une pipette multicanal et transférez 20 microlitres de l’échantillon dilué de la première à la deuxième colonne. Continuez la dilution en série jusqu’à ce que la dernière colonne soit atteinte, et jetez les 20 derniers microlitres de l’échantillon dilué.
Sceller la plaque avec du film et l’incuber à 25 degrés Celsius pendant sept jours dans une chambre humide. Après l’incubation, analyser la plaque au microscope inversé pour déterminer le dernier puits contenant des parasites pour chaque voie. Les parasites protozoaires de Leishmania existent sous deux formes développementales au cours de leur cycle de vie chez les hôtes invertébrés et vertébrés : les promastigotes et les amastigotes.
Les conditions axeniques peuvent simuler différents environnements hôtes in vitro, en maintenant la morphologie et la viabilité des parasites. Les conditions axeniques des amastigotes imitent l’environnement acide et l’augmentation de la température des hôtes vertébrés. Les promastigotes se différencieront en amastigotes dans ces conditions.
Lorsqu’ils sont transférés au pH neutre et incubés à 25 degrés Celsius, les amastigotes axeniques se transforment en promastigotes. La différence de virulence du type sauvage et des souches de KO leishmania Iron Regulator 1 a été observée sur les tapis de souris infectés. LIR1 régule les niveaux intracellulaires de fer en Leishmania, en médiatiser l’exportation de fer et en empêchant son accumulation intracellulaire à des niveaux toxiques.
L’analyse d’infection qui inclut la différence dans la progression de gonflement et de lésion a indiqué que LIR1 est essentiel pour L.amazonensis in vivo virulence. La charge parasite a été déterminée en effectuant un essai limitant de dilution des lésions infectées. Les lésions des souris infectées par KO LIR1 contiennent 10 à six fois moins de parasites que ceux des souris infectées par le type sauvage Leishmania, révélant que l’absence de LIR1 empêche la réplication intracellulaire des amastigotes.
Une des choses les plus importantes à retenir lorsque vous effectuez cette procédure est d’utiliser les cultures Leishmania qui ont été transmis in vitro moins de dix fois pour éviter la perte de virulence parasite. En plus de cette procédure, vous pouvez utiliser des analyses d’infection in vitro. Cependant, il s’agit d’une méthode limitée, car elle ne fournit pas une vue d’ensemble physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite.
Cette méthode in vivo est la meilleure approche pour évaluer les réponses systémiques pour la leishmaniose cutanée, telles que la quantification des biomarqueurs sériques dans les tissus hôtes récupérés pour d’autres études immunologiques.
