Cette technique permet d’observer de longs processus biologiques dans des chambres à œufs de drosophile disséquées, tels que la migration nucléaire des ovocytes, en utilisant la microscopie d’imagerie vivante. Ce protocole décrit comment maintenir les chambres à œufs disséquées en vie pendant 12 heures pour effectuer une microscopie d’imagerie en direct. Pour commencer, pipettez 200 microlitres de Schneider Medium et complétez avec 30 microlitres de 10 milligrammes par millilitre d’insuline, puis ajoutez quatre microlitres de sérum de veau fœtal inactivé à la chaleur.
Utilisez une pointe de pipette pour appliquer une petite quantité de graisse de silicone tout autour du trou sur la face inférieure de la glissière perforée. Positionnez un couvercle et utilisez l’extrémité large d’une pointe de pipette pour appliquer une pression sur le couvercle afin d’aplatir la graisse de silicone afin de créer un anneau en silicone à l’intérieur de la glissière. Transférer les mouches femelles anesthésiées dans le puits de dissection contenant 150 microlitres du milieu imageur.
Pour disséquer la femelle, utilisez la pince pour saisir le thorax et pincer la cuticule de l’abdomen dorsal avec une deuxième paire de pinces. Retirez soigneusement l’utérus, l’oviducte et la gaine musculaire. Isolez et détachez la paire d’ovaires visible sur l’ouverture de la cuticule.
Placez une goutte de 10 à 15 microlitres du milieu imageur sur les ovaires et transférez un ovaire dans la chambre d’imagerie. Pour séparer les ovarioles, utilisez l’aiguille pour maintenir l’extrémité postérieure de l’ovaire. Utilisez une autre aiguille pour tirer soigneusement le germarium pour taquiner les ovarioles.
Tenez la gaine avec une aiguille et tirez l’ovariole à travers les plus grandes chambres avec une autre aiguille pour enlever la gaine musculaire restante sur les chambres à œufs. Laissez l’ovariole non gainée couler et entrer en contact avec le couvercle. Retirez les derniers stades et le reste des ovaires de la microchambre à l’aide d’une pince.
Utilisez des aiguilles pour éloigner soigneusement les ovarioles afin de faciliter l’acquisition. Coupez un petit carré de 10 par 10 millimètres de la membrane perméable. Appliquez soigneusement la membrane sur le dessus du support d’imagerie pour expulser les bulles d’air.
Ensuite, scellez hermétiquement la chambre avec une fine couche d’huile d’halocarbure autour du puits sur le contour de la membrane. Placez la configuration d’imagerie sur le support de diapositive du microscope inversé et utilisez un objectif 40X. La migration du noyau ovocytaire d’une chambre à œufs de type sauvage a été capturée à l’aide de la microscopie d’imagerie vivante.
Le noyau atteint soit la membrane plasmique antérieure, soit la membrane plasmique latérale avant de glisser le long des trajectoires pour atteindre sa position finale à l’intersection des deux membranes plasmiques. Les déformations membranaires, les cellules folliculaires désorganisées, les cellules rabougries et les noyaux rétrécis sont les premiers signes de la mort des chambres à œufs. L’ovocyte dégénéré avant huit heures d’imagerie n’est généralement pas détecté.
Cependant, de rares cas de dégénérescence précoce sont dus à des problèmes lors des étapes de dissection ou de montage. Endommager les chambres à œufs compromet leur survie. La dissection délicate à la main précise et la préparation de la microchambre sont donc primordiales.
Cette procédure nous a permis de visualiser que le noyau de l’ovocyte peut prendre trois trajectoires différentes lors de sa migration et que différents organites régulent ces trajectoires au sein de l’ovocyte.
