Le carcinome épidermoïde de l’œsophage, ESCC, est mortel et répandu dans le monde entier. Les organoïdes tridimensionnels peuvent être utilisés pour accélérer les progrès sur le terrain afin de lutter contre le lourd fardeau de l’ESCC. Les organoïdes 3D dérivés de cellules uniques provenant de souris traitées avec 4NQO peuvent être manipulés facilement et à peu de frais pour l’annotation fonctionnelle des changements moléculaires accompagnant l’initiation et le développement de l’ESCC.
Ce modèle capture l’hétérogénéité génétique des tumeurs induites par les mutagènes. Par conséquent, ces organoïdes fournissent une plate-forme physiologiquement pertinente pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ou identifier les changements génétiques saillants à l’origine de la tumorigenèse. Yasuto Tomita, un associé du personnel, aidera à démontrer la dissection animale et la collection d’organes, et Norihiro Matsuura, un chercheur postdoctoral de mon laboratoire, aidera à démontrer la préparation de l’organoïde pour la procédure d’incorporation de paraffine.
Pour commencer, ouvrez la peau des souris euthanasiées en pinçant la fourrure abdominale médiane et en utilisant des ciseaux chirurgicaux, faites une incision craniocaudale, ventrale médiane du bas-ventre au menton. En commençant par l’incision médiane, faites des coupes radiales s’étendant jusqu’aux membres des deux côtés de la souris, gonflez les lambeaux de peau ouverts. Pour exposer la trachée cervicale, à l’aide de ciseaux à dissection, divisez les glandes salivaires à la ligne médiane.
Pour exposer la trachée thoracique, retirez le sternum. Pincez et soulevez doucement le péritoine avec une pince et utilisez des ciseaux pour diviser le péritoine crâniocaudale. et latéralement le long de la cage thoracique.
Rétractez doucement le foie de la surface caudale du diaphragme et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le diaphragme à l’encoche sternale, en particulier à la surface dorsale du processus xiphoïde. Une fois que la cage thoracique est séparée du contenu thoracique, insérez des ciseaux dans l’incision du diaphragme et disséquez crânienne la ceinture cervicale adhérant étroitement à la surface dorsale du sternum pour éviter d’endommager les organes inférieurs. Coupez les côtes de chaque côté du sternum à l’aide de ciseaux et retirez le sternum.
Pour exposer l’œsophage abdominal, soulevez doucement l’estomac antérieurement en tenant l’antre avec une pince. À l’aide de ciseaux, disséquer la rate, le pancréas et le mésentère de l’estomac et de l’œsophage. Pour exposer l’œsophage thoracique, soulevez doucement la trachée immédiatement caudale vers le cartilage thyroïdien et disséquez l’œsophage de la face dorsale de la trachée à l’aide de ciseaux d’iris.
Divisez la trachée au niveau du cartilage thyroïdien avec des ciseaux d’iris. Décollez la trachée du reste de l’œsophage en la disséquant soigneusement dans le sens caudal. Enlevez complètement le poumon, le cœur et le thymus avec la trachée.
Divisez l’estomac au niveau du pylore avec des ciseaux. Séparez l’œsophage de la vertèbre en tenant l’antre avec une pince et en disséquant crâniennement. Divisez l’œsophage au niveau du cartilage thyroïdien et récoltez l’œsophage et l’estomac ensemble.
Séparez l’estomac et l’œsophage en divisant l’œsophage au niveau du cardia et disséquez tout fascia sur la surface externe de l’œsophage. Pour réserver un échantillon à l’histologie, fendre longitudinalement avec des ciseaux. Placez le reste intact de l’œsophage et du PBS froid sur de la glace.
Ouvrez l’estomac le long de la plus grande courbure et lavez suffisamment avec du PBS. Séparer le préestomac et laver avec du PBS froid. Pour récolter la langue, retirez l’aiguille épinglée du nez et retirez la langue avec une pince à épiler.
Coupez la langue le plus longtemps possible et placez-la dans du PBS froid sur de la glace. Après avoir transféré le tissu dissocié dans une boîte de culture, retirez soigneusement la couche musculaire de l’épithélium à l’aide d’une pince. Transférer l’épithélium dans un tube microcentrifuge contenant 500 microlitres de trypsine à 0,25% et incuber dans un thermomélangeur pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 800 tr / min.
Après une brève centrifugation, transférer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres maintenue sur un tube conique de 50 millilitres avec une pointe de large alésage en utilisant des mouvements circulaires, puis ajouter 3 millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja, ou ITS, à travers la passoire en utilisant des mouvements circulaires pour laver, puis frotter la crépine avec la base d’un piston de seringue à tuberculine de 1 millilitre pour pousser les cellules à travers. Lavez la passoire avec 3 millilitres de PBS 3 à 5 fois, en frottant la crépine avec la base de la seringue entre les lavages. Après avoir enduit les cellules par centrifugation, retirer le surnageant en laissant 1 millilitre de solution dans le tube pour la remise en suspension.
Une fois la pastille remise en suspension, transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Après avoir centrifugé à nouveau le tube, remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de milieu organoïde de souris, ou MOM, et effectuez un comptage automatisé des cellules. Plaque 5 000 cellules viables dans 75% d’extrait de membrane basale, ou BME, et MOM avec 50 microlitres de volume total par puits.
À l’aide d’une pointe de 200 microlitres à large alésage, ajoutez lentement une gouttelette de 50 microlitres au centre de chaque puits en évitant le contact entre la pointe et le fond ou les côtés du puits. Laissez le BME se solidifier pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité relative. Après l’incubation, ajoutez soigneusement 500 microlitres de MOM par puits.
Changez le MOM le jour 3 ou 4, puis tous les 2 à 3 jours par la suite jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le passage. Gardez le BME décongelé sur la glace, préchauffez le MOM, 0,05% de trypsine et les IST à 37 degrés Celsius avant utilisation. À l’aide d’une pointe de micropipette de grand calibre, collectez les organoïdes dans le dôme BME avec le surnageant et perturbez le BME en pipetant de haut en bas.
Après avoir obtenu la pastille organoïde par une brève centrifugation, une fois délogée, la remettre en suspension dans 500 microlitres de trypsine à 0,05%. Incuber le tube dans un thermomélangeur à 37 degrés Celsius et 800 tr/min pendant 10 minutes. Inactiver la trypsine avec 600 microlitres d’ITS.
Après avoir centrifugé et jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 microlitres de MOM. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan. Pour fixer les organoïdes, délogez délicatement la pastille et remettez-la en suspension dans 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant une nuit à 4 degrés Celsius.
Ensuite, préparez une surface d’encastrement en inversant un support de tubes microcentrifugés et en recouvrant la surface d’une feuille de film de plafond, puis étiquetez avec l’identifiant organoïde correspondant. Recouvrir soigneusement le paraformaldéhyde enlevé dans la pastille organoïde lavée au PBS en ajoutant 50 microlitres de gélose sur le côté du tube. Répétez cette étape.
Sans déranger la pastille, transférer la pastille dans la gouttelette de gel gélosé sur le film du plafond sur la surface d’encastrement pour une solidification à 4 degrés Celsius pendant 45 minutes. À l’aide d’une pince, transférer délicatement la gouttelette contenant la pastille organoïde solidifiée dans une cassette de pathologie étiquetée. Les organoïdes murins normaux de la langue œsophagienne et du préestomac ont été analysés morphologiquement par imagerie en fond clair et coloration histologique.
Le carcinome épidermoïde de l’œsophage d’une souris traitée au 4NQO présentait une atypie nucléaire et une kératinisation abrupte. La capacité d’auto-renouvellement des organoïdes évaluée en déterminant le taux de formation d’organoïdes lors de la sous-culture a montré que le taux de formation diminue en fonction du temps reflétant la diminution des cellules basaloïdes prolifératives dans les organoïdes matures. La cinétique de croissance des organoïdes est révélée par leur morphologie à différents moments.
La kératinisation du noyau interne des organoïdes devient proéminente au jour 10. Les cellules basaloïdes prolifératives restent dans la couche cellulaire la plus externe, même aux jours 14 et 21. Une courbe de doublement de la population d’organoïdes normaux de la langue de souris générés à partir de souris non traitées 4NQO démontre leur croissance régulière sur de multiples passages et une culture à long terme.
Les organoïdes sont des plates-formes de criblage à haut débit pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, l’édition basée sur CRISPR pour interroger la fonction spécifique des gènes ou la co-culture pour définir quelles interactions dans le microenvironnement tumoral influencent la transformation. Cette technique nous a permis d’étudier des phénomènes tels que l’EMT partiel et l’infection par le VPH, ainsi que leur interaction avec le système immunitaire dans la biologie des cancers épidermoïdes des voies aérodigestives.
