חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

Summary

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

Abstract

תכונות מכניות תאיות מעורבות במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, החל מהתמיינות תאי גזע ועד גרורות סרטניות. שיטות קונבנציונליות למדידת תכונות אלה, כגון מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) ושאיפת מיקרופיפטה (MA), לוכדות מידע עשיר, המשקף את התגובה הצמיגית המלאה של התא; עם זאת, שיטות אלה מוגבלות על ידי תפוקה נמוכה מאוד. גישות בעלות תפוקה גבוהה, כגון ציטומטריה של עיוות בזמן אמת (RT-DC), יכולות למדוד רק מידע מכני מוגבל, מכיוון שלעתים קרובות הן מוגבלות לקריאות של פרמטר יחיד המשקפות רק את התכונות האלסטיות של התא. בניגוד לשיטות אלה, חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS) היא פלטפורמה מיקרופלואידית גמישה, נטולת תוויות, המגשרת על הפער בהשגת מדידות ויסקו-אלסטיות מרובות פרמטרים של תא בעל תפוקה מתונה. מדידת זרם ישר (DC) משמשת לניטור תאים בזמן שהם עוברים בתעלה מיקרופלואידית, ועוקבת אחר גודלם ומהירותם לפני, במהלך ואחרי שהם נאלצים לעבור התכווצות צרה. מידע זה (כלומר, גודל ומהירות) משמש לכימות העיוות הרוחבי של כל תא, עמידות בפני דפורמציה והתאוששות מעיוות. באופן כללי, פלטפורמה מיקרופלואידית זו, המבוססת על אלקטרוניקה, מספקת תכונות ויסקו-אלסטיות מרובות של התא, ובכך תמונה מלאה יותר של המצב המכני של התא. מכיוון שהיא דורשת הכנת דגימה מינימלית, משתמשת במדידה אלקטרונית פשוטה (בניגוד למצלמה במהירות גבוהה), ומנצלת את ייצור הליתוגרפיה הרכה הסטנדרטית, היישום של פלטפורמה זו הוא פשוט, נגיש וניתן להתאמה לניתוח במורד הזרם. הגמישות, התועלת והרגישות של פלטפורמה זו סיפקו מידע מכני ייחודי על מגוון רחב של תאים, עם פוטנציאל ליישומים רבים נוספים במדע בסיסי ובאבחון קליני.

Introduction

תאים בודדים הם חומרים דינמיים, ויסקואלסטיים¹. ריבוי תהליכים פנימיים וחיצוניים (למשל, הופעת מיטוזה או שיפוץ מחדש של המטריצה החוץ-תאית [ECM]), משפיעים על המבנה וההרכב שלהם ^2,3,4, ולעתים קרובות התוצאה היא תכונות ביופיזיות נפרדות המשלימות את מצבם הנוכחי. בפרט, תכונות מכניות הוכחו כסמנים ביולוגיים חשובים של התפתחות תאים, פיזיולוגיה ופתולוגיה, המניבים מידע כמותי רב ערך שיכול להשלים גישות מולקולריות וגנטיות קנוניות ^5,6,7. לדוגמה, Li et al. תיארו לאחרונה את ההבדלים המכניים בין תאי לוקמיה פרומיאלוציטיים חריפים עמידים לתרופות ומגיבים לתרופות, תוך שימוש ב-RNA-seq כדי לחשוף גנים הקשורים לציטוסקלטון⁸ המתבטאים באופן דיפרנציאלי. על ידי הבנת יחסי הגומלין המורכבים בין מכניקת התא הבודד לבין תפקוד התא, למכנופנוטיפינג יש יישומים רחבים יותר בשינוי המדע הבסיסי והאבחון הקליני⁹.

הכלי הנפוץ ביותר למדידת מכניקה של תא בודד הוא מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). בעוד ש-AFM מאפשר מדידה מקומית ברזולוציה גבוהה של תכונות מכניות סלולריות, הוא נותר מוגבל לתפוקה של <0.01 תאים לשנייה¹⁰. לחלופין, אלונקות אופטיות, המשתמשות בשתי קרני לייזר מסתעפות כדי ללכוד ולעוות תאים בודדים תלויים¹¹, מוגבלות לתפוקה גבוהה יותר באופן שולי של <1 תאים/שנייה¹². ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיות אפשרה דור חדש של התקנים להערכה מכנית מהירה, חד-תאית,^12,13. טכניקות אלה משתמשות בתעלות כיווץ צרות 14,15, זרימת גזירה 16, או מתיחה הידרודינמית¹⁷ כדי לעוות תאים במהירות בתפוקות של 10-1,000 תאים לשנייה ¹⁸. בעוד שקצב המדידה של גישות אלה מהיר משמעותית מטכניקות קונבנציונליות, לעתים קרובות הן מחליפות יכולות תפוקה גבוהה עבור קריאות מכניות מוגבלות (טבלה משלימה 1). כל השיטות המיקרופלואידיות המהירות שהוזכרו לעיל מתמקדות במדדים בסיסיים בעלי פרמטר יחיד, כגון זמן מעבר או יחסי עיוות, המשקפים רק את התכונות האלסטיות של התא. עם זאת, בהתחשב באופי הצמיגי הפנימי של תאים בודדים, אפיון מכני חזק ויסודי של תאים דורש התחשבות לא רק ברכיבים אלסטיים אלא גם בתגובות צמיגות.

חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS)^2,8 (איור 1A) היא פלטפורמה מיקרופלואידית שמטפלת במגבלות הקיימות באמצעות מכנופנוטיפ חד-תאי. שיטה זו מאפשרת מדידה של מספר פרמטרים ביופיזיים בו זמנית, כולל קוטר התא, עיוות יחסי וזמן התאוששות מעיוות, עם תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה. טכניקה זו מבוססת על חישת נקבוביות צמתים (NPS)19,20,21,22,23,24, הכוללת שימוש במדידת בדיקה בת ארבע נקודות כדי למדוד את פולס הזרם המווסת המיוצר על ידי תא העובר בתעלה מיקרופלואידית אשר פולחה על ידי אזורים רחבים יותר^, המכונים "צמתים". פולס הזרם המווסת הוא תוצאה של התא שחוסם חלקית את זרימת הזרם במקטעים (כלומר, "נקבוביות") ובצמתים, כאשר יותר זרם חסום בראשון מאשר באחרון. במכאנו-NPS, מקטע אחד, "תעלת הכיווץ", צר יותר מקוטר התא; כתוצאה מכך, תא חייב להתעוות כדי לעבור את כל הערוץ (איור 1B). ניתן לקבוע את קוטר התא על ידי גודל התת-פולס שנוצר כאשר התא עובר את נקבוביות הצומת לפני ערוץ ההתכווצות (איורים 1B,C). כאן, |ΔI_np|, הטיפה הנוכחית כאשר התא נמצא בנקבובית, פרופורציונלית ליחס הנפח של התא לנקבובית, _{נקבובית תא}/V 2,8,19. ניתן לקבוע את קשיחות התא על ידי ΔT_c, משך הזמן של תת-הדופק הגדול יותר באופן דרמטי שנוצר כאשר התא עובר את תעלת הכיווץ (איורים 1B,C). תא נוקשה יותר ייקח זמן רב יותר לעבור את התעלה מאשר תא רך^{יותר 2,8.} לבסוף, "התאוששות" התא, יכולתו של התא לחזור לגודלו ולצורתו המקוריים לאחר העיוות, יכולה להיקבע על-ידי סדרת תת-הפולסים המיוצרים כאשר התא עובר את נקבוביות הצומת לאחר ערוץ ההתכווצות (איורים 1B,C). זמן ההחלמה, ΔT_r, הוא הזמן שלוקח לתת-פולסים הנוכחיים לחזור לגודל של תת-הפולסים הקודמים, לפני שהתא נסחט. באופן כללי, פולסי הזרם המווסתים המיוצרים כאשר תא עובר את התעלה המיקרופלואידית מתועדים ומנותחים כדי לחלץ את הפרמטרים המכניים הרלוונטיים של תא יחיד (איור 1D)^2,8.

יכולת השחזור וקלות השימוש בפלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה זו הודגמו בעבר²⁵. בנוסף, הפלטפורמה מהווה חסם כניסה נמוך עבור מכנופנוטיפינג חד-תאי. ליתוגרפיה רכה סטנדרטית משמשת לייצור התקנים מיקרופלואידיים. חומרת המדידה מורכבת מרכיבים זולים, כולל מעגל מודפס פשוט (PCB), ספק כוח, preamplifier, לוח איסוף נתונים (DAQ) ומחשב. לבסוף, קוד ידידותי למשתמש זמין לרכישה וניתוח של נתונים, ומאפשר יישום פשוט. טכניקה זו של מכניופנוטיפינג יכולה להבחין בין אוכלוסיות של קווי תאי אפיתל שדיים וריאות לא ממאירים וממאירים, להבחין בין תת-שומנות בתאי אפיתל ראשוניים של יונקים אנושיים, ולאפיין את ההשפעות של הפרעות ציטוסקלטליות וחומרים פרמקולוגיים אחרים ^2,8. באופן כללי, פלטפורמה זו היא גישה יעילה עבור mechanophenotyping של תאים בודדים.

Protocol

1. עיצוב גיאומטריה של המכשיר

1. בחר את רוחב מקטעי הגודל והשחזור כך שיהיה רחב יותר מקוטר התאים הגדולים ביותר שיש למדוד, אך גם שומר על יחס אות לרעש (SNR) מספיק. ראה טבלה משלימה 2 לקבלת דוגמאות לרוחב מקטעי גודל ושחזור שונים עבור קווי תאים שונים.
2. בחר את רוחב מקטע הכיווץ כדי להחיל זן של 30%-40% על הגודל הממוצע של התאים שאמורים לעבור מכנופנוטיפ. זן מוגדר כ- , כאשר d הוא קוטר התא ו- w_c הוא רוחב ערוץ הכיווץ ^2,8. ראה טבלה משלימה 2 לרוחבי מקטעי כיווץ שונים עבור קווי תאים שונים.
   הערה: אם רוצים להשוות סוגי תאים או תנאים עם קטרים שונים באופן מהותי, יש להשתמש בעיצובי מכשירים נפרדים עם רוחבי מקטעי כיווץ ספציפיים לכל סוג/מצב תא.
3. תכנן התקן ייחוס עבור כל גיאומטריה ייחודית של התקן. זה הכרחי לקביעת D_e, הקוטר האפקטיבי של קטע נקבוביות גודל של הערוץ microfluidic.
   הערה: התקן הייחוס משתמש באותה גיאומטריה כמו ההתקן הראשי. השינוי היחיד הוא שמקטע הכיווץ צריך להיות שווה ברוחבו למקטע הנקבוביות הגודל כדי לאפשר כיול עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע. הרחבת הכיווץ מונעת מחרוזי הפוליסטירן לסתום את תעלת הכיווץ במהלך הכיול. תהליך הכיול מתואר בהרחבה בשלבים 4.1 ו- 5.3.1. כיול יכול להתבצע גם באמצעות מונה תאים זמין מסחרית, ובמקרה זה, אין צורך במכשיר ייחוס. תהליך זה מתואר בשלב 4.2.
4. בחר את גובה הערוץ כך שהתאים הגדולים ביותר בעלי העניין יוכלו להתארך באופן מלא ללא הגבלה בתוך מקטע הכיווץ². ודא שגובה התעלה גדול _{מ-h min} (זאת בהנחה שהתא הוא כדורי לפני דפורמציה, ושהעיוות האיזומטרי מתרחש לאורך התעלה וגובהה במהלך העיוות).
   הערה: בהינתן הגודל של תת-פולס נוכחי, , ככל _{ש-h min} גדול יותר, כך ה-SNR הכולל יהיה נמוך יותר.
5. תכנן וצור מסיכת צילום באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב עם רוחב הערוצים שנבחר. קובץ לדוגמה מופיע בקובץ משלים 1. הגדילו את עיצוב המסכה המיקרופלואידית ב-1.5% כדי להסביר את ההתכווצות של פולידימתילסילוקסן (PDMS) לאחר קילוף מהמאסטר השלילי.
   הערה: ניתן לכלול מערך התקנים על מסכה אחת כל עוד המערך הכולל אינו חורג מגודל הוופל (איור משלים 1A).
6. תכננו וצרו מסכת פוטו עם אלקטרודות שישמשו לביצוע מדידה של ארבע נקודות של זרם המכשיר המיקרופלואידי (איור 1D). קובץ לדוגמה מופיע בקובץ משלים 1.
   הערה: ניתן לכלול מערך של אלקטרודות על מסכה אחת כל עוד המערך אינו חורג מגודל שקופית הזכוכית (איור משלים 1B).

2. התקני ייצור (איור 2)

1. הכינו תבניות אלקטרודה על מצע זכוכית.
   1. סובבו את הציפוי, התבנית ועבדו פוטו-סיסט חיובי על גבי שקופית זכוכית רגילה בהתאם לגיליון נתוני המוצר. דוגמה להליך זה מתוארת בקובץ משלים 2.
   2. בצע תצהיר מתכת, הרמה ותחריט זהב.
      1. בצע תצהיר סרט דק של 75 Å Ti, 250 Å Pt ו- 250 Å Au על המגלשה. דוגמה להליך זה באמצעות אידוי אקדח אלקטרונים מתוארת בקובץ משלים 3.
      2. יש לטבול את המגלשה באצטון למשך 15 דקות כדי לבצע הרמה של עודפי מתכת.
      3. במכסה אדים, השתמשו בפיפטה חד-פעמית כדי להפיל יציקת זהב על אזור האלקטרודות שייחשפו לתעלה המיקרופלואידית, כפי שמוצג באיור משלים 2. היזהר כדי להימנע מהשמטת etchant במקום אחר בשקופית.
         אזהרה: אצטרובל זהב עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. אין לנשום אדים, ואין לבלוע. טפלו בזהירות, לבשו ציוד מגן אישי מתאים (PPE) והשליכו פסולת בהתאם לתקנות הסילוק המקומיות.
      4. שטפו את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה (DI) ויבשו אותה בחנקן יבש (N₂).
   3. אם מספר אלקטרודות מודפסות על אותה שקופית זכוכית, חפרו את השקופית לשבבים בודדים.
      1. השתמש בכלי חיתוך זכוכית כדי להבקיע את השקופית לאורך גבולות האלקטרודה המעוצבת.
      2. שברו את הזכוכית לאורך הציון כדי לחלק את השקופית לשבבים בודדים.
   4. בדוק חזותית את האלקטרודות תחת מיקרוסקופ. ודא שאלקטרודות בודדות אינן פתוחות חשמלית או שאלקטרודות אינן מקוצרות זו לזו.
2. לייצר תבנית אב שלילית עבור ערוצים.
   1. סובבו את הציפוי, התבנית ועבדו התנגדות אפוקסי SU-8 על פרוסת סיליקון מלוטשת בהתאם לגיליון נתוני המוצר. דוגמה להליך זה מתוארת בקובץ משלים 2.
   2. מדוד גבהי תכונות באמצעות פרופילומטר ובדוק באופן חזותי את התכונות תחת מיקרוסקופ (איור משלים 3). ודא שהגיאומטריות הרצויות מוגדרות היטב.
3. עובש ערוצי PDMS עם ליתוגרפיה רכה.
   1. הכינו PDMS על ידי שקילת אלסטומר וקרוסלינקר ביחס מסה של 10:1 בכוס חד פעמית.
      הערה: עבור רקיק בקוטר 3 אינץ ', 30 גרם של PDMS מספיק.
   2. ערבבו את ה-PDMS במרץ במשך 30 שניות עם מזלג חד פעמי, עד שה-PDMS אטום עם בועות.
   3. נטרלו את הגז PDMS בתא ואקום למשך כ-30-90 דקות, או עד שה-PDMS יהיה שקוף ללא בועות נראות לעין.
   4. מניחים את הוופל עם התבנית הראשית SU-8 לתוך צלחת פטרי חד פעמית ויוצקים PDMS על מרכז הוופל.
   5. מניחים את צלחת הפטרי המכילה את ה-PDMS ואת הוופל בתא ואקום ומנטרלים את הגז למשך כ-30 דקות, או עד שלא נשארות בועות ב-PDMS.
   6. אופים את ה-PDMS בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בתנור או על פלטה חשמלית.
   7. עם להב חד, לחתוך ולהסיר את PDMS מן המאסטר שלילי SU-8.
   8. חותכים את לוח ה-PDMS המעוצב לתבניות נפרדות באמצעות להב חד
   9. ליבת חורי הגישה לכניסה וליציאה באמצעות ניקוב ביופסיה חד פעמי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בניקוב חדש עבור כל לוח PDMS. ניקוב חד יותר מייצר חורים בעלי קצוות חלקים, הממזערים חלקיקים שעלולים לחסום את תעלת הכיווץ.
      הערה: קוטר חורי הגישה צריך להיות מעט פחות מהקוטר החיצוני של הצינורות. לדוגמה, אם משתמשים בצינורות polytetrafluoroethylene (PTFE) בקוטר חיצוני של 1/32 אינץ ', יש לנקב חור של 1.5 מ"מ.
4. חברו מצע זכוכית/אלקטרודה לערוצי PDMS.
   1. נקו את שקופיות הזכוכית האלקטרודה עם מתנול (≥99.8%). יבש עם יבש N₂.
   2. נקו את מכשיר ה-PDMS עם סרט סקוטש, ולאחר מכן שטפו אותו עם איזופרופיל אלכוהול (IPA) ומים שעברו דה-יוניזציה (DI; 18 MΩ/cm²). יבש עם יבש N₂. לאחר מכן, לנקות עם סרט סקוטש פעם נוספת.
   3. הניחו את מצע הזכוכית עם אלקטרודות טרומיות ואת תבנית PDMS המוכנה (צד תכונה כלפי מעלה) לתוך חומר ניקוי פלזמה.
   4. חשוף את שניהם לפלסמה חמצן למשך 2 דקות (100-300 mTorr, 30 W).
   5. יישרו והניחו את תבנית ה-PDMS כשצד התכונה פונה כלפי מטה על מצע הזכוכית עם אלקטרודות טרומיות.
      הערה: ההדבקה מתבצעת באופן מיידי ברגע שה-PDMS והזכוכית המטופלים בפלזמה באים במגע; כתוצאה מכך, שינויי יישור נוספים לא יתאפשרו. כדי להקל על היישור, ניתן להעביר 20 μL של דילול 2:1 של מתנול במי DI על משטח הזכוכית המטופל בפלזמה. תמיסת המתנול משמשת כמחסום פיזי בין הזכוכית המטופלת לבין PDMS, ומאפשרת התאמות יישור. אם משתמשים במתנול, אופים את המכשיר המיושר והמזווג בטמפרטורה של 50°C למשך שעתיים כדי לאדות את התמיסה ולהשלים את תהליך ההדבקה.
   6. בדוק חזותית את המכשיר מלוכד תחת מיקרוסקופ. ודא שהאלקטרודות וגיאומטריות הערוץ מיושרות כהלכה.

3. מדידת תאים (איור 1D)

1. הכן את מקור הלחץ, ה- PCB, חומרת הספסל ותוכנת איסוף הנתונים.
   1. חבר את ההתקן המיקרופלואידי ללוח המעגלים המודפסים באמצעות המהדק. דוגמה ל- PCB מופיעה בקובץ משלים 4 (קבצי GERBER) ובקובץ משלים 5 (קבצי רשימה סכמטיים, לוחות וחלקי PCB).
      1. יישר את הפינים הטעונים בקפיץ של המהדק עם רפידות המגע של האלקטרודה במכשיר המיקרופלואידי ויישר את פיני ראש המהדק עם החורים בלוח המעגלים המודפסים.
      2. הכנס בחוזקה את פיני הראש של המהדק לתוך חורי ה- PCB, וודא שהפינים הטעונים בקפיץ נשארים מיושרים עם רפידות המגע של האלקטרודה.
   2. הגדר וחבר את החומרה האלקטרונית.
      1. חבר שתיים מיציאות הפלט של ספק הכוח ליציאת מתח האספקה של ה-PCB באמצעות מתאם נקבה כפול של בננה ל-Baynet-Neill-Concelman (BNC) וכבל BNC.
      2. הפעל את ספק הכוח. הגדר את הפלט המחובר למוליך הפנימי של ה-BNC ל-+15 V והגדר את הפלט השני ל-15 V. אפשר לשתי היציאות להפעיל את המעגל.
      3. חבר את השלישי מבין יציאות היציאה של ספק הכוח ליציאת מתח הכניסה של ה- PCB באמצעות כבל BNC. הגדר את הפלט למתח המופעל הרצוי, אך אל תפעיל אותו עד לתחילת הניסוי.
      4. חבר את יציאת זרם הפלט של ה- PCB לקלט של קדם-המגבר הנוכחי באמצעות כבל BNC.
      5. חבר את הפלט של קדם-המגבר הנוכחי לכניסה אנלוגית אחת בבלוק מסוף BNC של מערכת רכישת הנתונים באמצעות כבל BNC. לחלופין, חבר מסנן אנלוגי בעל מעבר נמוך בקו עם כבל BNC כדי לסנן הפרעות בתדר גבוה.
         הערה: כדי לשפר את ה-SNR, ייתכן שה-PCB וההתקן מאוחסנים בתוך מארז מתכת עבה. ניתן לנתב את כל כבלי BNC וצינורות נוזליים דרך חורים שנקדחו לתוך המארז.
   3. התקן והגדר את התוכנה הנדרשת במחשב האישי (PC)
      1. הפעל וחבר את בקר הלחץ למחשב. התקן את כל תוכנות בקר הלחץ הנדרשות בהתאם להוראות היצרן.
      2. התקן את MATLAB ואת ארגז הכלים לרכישת נתונים במחשב. ודא שמנהלי ההתקנים הדרושים עבור מערכת רכישת הנתונים מותקנים כך שממשק ארגז הכלים לרכישת נתונים של MATLAB יוכל לזהות אותה.
      3. הורד את סקריפט רכישת הנתונים הכלול, "NPS.m", מתוך https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
   4. פתח וקבע את התצורה של קובץ ה- Script לרכישת נתונים.
      1. הגדר את הערכים הנכונים לאתחול הפעלת רכישת הנתונים, הכוללת את מזהה הספק, מזהה ההתקן של ה- DAQ ומספר ערוץ הקלט האנלוגי (שורות 34-36 בסקריפט הכלול).
         הערה: ניתן למצוא את מזהה המכשיר באמצעות הפונקציה "daq.getDevices" או "daqlist".
      2. הגדר את קצב הדגימה הרצוי לרכישה (שורה 23 בסקריפט הכלול). לקבלת תוצאות אופטימליות, זה צריך להיות מוגדר לפחות 10 קילוהרץ.
2. הכן את השעיית התא.
   1. הכינו תמיסה של 2% סרום בקר עוברי (FBS) בתמיסת מלח 1x עם אגירת פוספט (PBS), וסננו עם מסנן של 0.22 מיקרומטר.
   2. תרבית והכן את התאים על פי פרוטוקול תרבית התאים המתאים של קו התאים המועדף. להשעות את התאים בתמיסה מוכנה של 2% FBS ב 1x PBS בריכוז של 1-5 x 10^{5 תאים} / מ"ל. שמור את התאים על הקרח למשך הניסויים.
3. מדוד את התכונות הפיזיקליות של התאים.
   1. טען את דגימת התא לתוך הצינורות וחבר אותה לכניסת המכשיר.
      1. חותכים 30 ס"מ של צינורות PTFE בעזרת סכין גילוח או סכין חדה.
      2. חברו קצה אחד של הצינורות למזרק מנעול לואר. השתמש במזרק כדי למשוך את דגימת התא לקצה השני של הצינור.
      3. הכנס בזהירות את הצינורות לתוך הכניסה של המכשיר.
      4. חבר את הקצה הנגדי של הצינורות לבקר הלחץ המיקרופלואידי.
         הערה: ניתן להוסיף מסנן בין בקר הלחץ המיקרופלואידי לבין הצינורות כדי למנוע זרימה חוזרת של נוזלים לבקר הלחץ.
   2. הפעל את הניסוי.
      1. הגדר את לחץ הנהיגה הקבוע הרצוי בתוכנת בקר הלחץ ואפשר לדגימה למלא את המכשיר.
         הערה: הלחץ הוא בדרך כלל 2-21 kPa. מהירות הזרימה חייבת להיות איטית מספיק כדי לאפשר פולסים מוגדרים בבירור, אך מהירה מספיק כדי לאפשר תפוקה מספקת.
         1. אם נוצרות בועות בתעלות המיקרופלואידיות, השתמש במילוי ללא מוצא: חבר את שקע ההתקן והפעל לחץ נמוך על הכניסה כדי להוציא אוויר דרך ה-PDMS החדיר לגז. השארת בועות בערוץ תוביל לקו בסיס זרם לא יציב ותמנע מדידות מדויקות.
         2. אם פסולת סותמת את התעלה המיקרופלואידית, יש לנתק אותה על-ידי לחיצה קלה על החלק העליון של התקן ה-PDMS תוך כדי הפעלת לחץ הנהיגה, "פעימת" לחץ גבוה יותר על-ידי הפעלה וכיבוי של הלחץ, או הסרת הצינור והכנסתו מחדש. אם הפסולת נשארת, ייתכן שיהיה צורך לעבור למכשיר חדש.
      2. הגדר את המתח הרצוי על-ידי סיבוב כפתור המתח בספק הכוח והפעל את המתח על-ידי לחיצה על לחצן מופעל .
         הערה: המתח הוא בדרך כלל 1-5 V. בחר את המתח הנמוך ביותר הדרוש עבור SNR הולם. יש להשתמש באותו מתח בכל התנאים להשוואה.
      3. הפעל את קדם-המגבר הנוכחי והגדר את הרגישות (A/V) נמוכה ככל האפשר; לחלופין, הגדר את הרווח (V/A) גבוה ככל האפשר מבלי להעמיס יתר על המידה על הקדם-אמפליפייר או לחרוג ממתח הכניסה האנלוגי המרבי של ה-DAQ. במחקר זה, הרגישות הוגדרה ^ל-10-7 A/V.
         הערה: ערך הרגישות/רווח הנכון יהיה תלוי הן במתח המופעל והן בהתנגדות הבסיסית של התעלה המיקרופלואידית.
      4. לחץ על לחצן ההפעלה הירוק בתפריט רצועת הכלים MATLAB כדי להתחיל את סקריפט רכישת הנתונים NPS.m ולהתחיל לדגום ולשמור את הנתונים.
      5. כדי לסיים את הניסוי, לחץ על לחצן עצור בפינה השמאלית התחתונה של חלון האיור כדי לעצור את סקריפט רכישת הנתונים. השבת את פלט ספק הכוח על-ידי לחיצה על לחצן מופעל . הגדר את מקור הלחץ ללחץ אפס בתוכנת בקר הלחץ.
      6. בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי כדי לבצע אחת או יותר מהפעולות הבאות:
         1. החלף את ההתקן הנוכחי בהתקן חדש.
         2. טען מחדש את הצינורות עם דגימות תאים נוספות.
            הערה: כדי למנוע זיהום צולב לדוגמה, השתמש בהתקנים חדשים כדי למדוד תאים מסוגים או תנאים שונים.
         3. שחרר את המכשיר מה- PCB ובדוק את מצב הערוץ תחת מיקרוסקופ. כדי להפעיל מחדש את הניסוי באמצעות אותו מכשיר, יש להיזהר שלא להכניס בועות אוויר. ייתכן שיהיה צורך להפעיל לחץ עדין על בוכנת המזרק כדי לשמור על דגימת התא בקצה הצינור תוך הכנסתה לכניסת המכשיר.

4. כיול המכשיר המיקרופלואידי

1. אפשרות 1: מדוד את חרוזי הפוליסטירן במכשירי ייחוס.
   1. בחר גודל חרוז פוליסטירן הקטן מערוץ הגודל.
   2. הוסיפו 1.5% חרוזי טווין ופוליסטירן לתמיסת PBS ו-FBS המסוננת המשמשת במהלך ניסויי התא, בריכוז של 1-3 x 10⁵ חרוזים/מ"ל.
   3. המשך בניסוי כמתואר בסעיף 3, תוך שימוש בהתקן הייחוס המתואר בשלב 1.3, והפעל את אותו מתח המשמש במהלך הניסוי. השתמש בגודל הממוצע של הטיפה הנוכחית המיוצרת כאשר חרוזים עוברים את נקבוביות הגודל ואת הקוטר הידוע של החרוזים כדי לחשב _{את D e}, כמתואר בסעיף 5.
2. אפשרות 2: מדוד באופן עצמאי את גודל התא באמצעות מכשיר מדידה נפרד.
   1. במקום לעקוב אחר הפרוטוקול בשלב 4.1, השתמש במכשיר מסחרי למדידת גודל התא כדי למדוד את הגודל הממוצע של התאים בדגימה. במקרה זה, אין צורך במכשיר ייחוס. השתמש בטיפת הזרם הממוצעת הנוצרת כאשר תאים עוברים את נקבובית הגודל ואת קוטר התא הממוצע הנמדד כדי לחשב את D_e כמתואר בסעיף 5.

5. ניתוח נתונים לחילוץ פנוטיפים של תאים

הערה: ניתן לבצע עיבוד נתונים באמצעות קובץ תוכנית ממשק שורת הפקודה MATLAB mNPS_procJOVE.m בשעה https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. ראה קובץ משלים 6 לקבלת הוראות נוספות.

1. עיבוד מקדים של הנתונים (איור 3A).
   1. חשב את הזרם החשמלי הנמדד על-ידי החלת ערך הרווח המשמש בקדם-אמפליפייר מזרם למתח על הנתונים הגולמיים הנרכשים על-ידי ה- DAQ.
   2. הסר רעשים בתדר גבוה על-ידי החלת פונקציית החלקה מלבנית ו/או מסנן מעבר נמוך על מדידת הזרם הגולמי. לאחר מכן, דגום מחדש את הנתונים המסוננים לקצב דגימה נמוך יותר. כמו כן, חשב את נתוני חותמת הזמן המתאימים בקצב דגימה נמוך זה.
   3. חשב אות זרם בסיסי מותאם על-ידי יישום שיטה כגון החלקת ריבועים מינימליים אסימטריים²⁶.
   4. חשב את הנגזרת הראשונה המשוערת (אות ההפרש) של הנתונים הנוכחיים המעובדים מראש על-ידי לקיחת ההפרש בין נקודות הנתונים הבאות.
2. זהה אירועים בתאים וחלץ נתוני תת-פולסים (איור 3B).
   1. חפש אירועים סלולריים מועמדים על ידי בחינת הנתונים המעובדים מראש. דחיית אירועי תאים החופפים לאירועי תא אחרים (כלומר, אירועי צירוף מקרים) (איור משלים 4), הצגת התאמה בסיסית ירודה, או צורת פולס בלתי צפויה או שגויה (לדוגמה, כאשר ייתכן שסתום היה נוכח בערוץ).
   2. חלץ נתוני תת-פולס עבור כל אירוע תא.
      1. כל מקטע נקבוביות של צומת יופיע כתת-פולס מתאים בתוך פולס האות הכולל (איורים 1B, C). זהה את ההתחלה של כל תת-פולס על-ידי חישוב נקודת הזמן שבה אות ההפרש מגיע לערך מינימלי מקומי. זהה את הקצה של כל תת-פולס על-ידי חישוב נקודת הזמן שבה אות ההפרש מגיע לערך מרבי מקומי.
      2. קבע את הרוחב של כל תת-פולס כזמן שחלף בין נקודות זמן ההתחלה והסיום. קבע את המשרעת של כל תת-מתח על-ידי חישוב ממוצע ההפרש בין הזרם הנמדד לזרם הבסיסי עבור כל נקודות הנתונים בין נקודות זמן ההתחלה והסיום.
3. קבע את המכנופנוטיפ של התא עבור כל אירוע תא בהתבסס על נתוני תת-התנועה.
   1. קבע את קוטר התא d בהתבסס על המשוואה שהוגדרה על ידי Deblois ו- Bean²⁴:
      
      כאשר ΔI/I הוא היחס הממוצע בין משרעת תת-פולס לזרם בסיסי בתת-פולסים של הגודל, D_e הוא הקוטר האפקטיבי של הערוץ (נמדד בשלב 4), ו-L הוא האורך הכולל של ערוץ הצומת-נקבובית.
      1. D e נקבע על ידי חישוב ה-ΔI/I הממוצע המיוצר על ידי קבוצה של חלקיקים בקוטר ידוע (תאים או חרוזים, ראה שלב 4), תוך שימוש בקוטר ידוע זה כ-d, ופתרון Eq. 1 עבור D_e.
   2. לכמת את עמידות התא בפני דפורמציה.
      1. קבע את מהירות הנוזל _{U זרימה} על ידי חישוב מהירות התא הממוצעת בתת-פולסים של גודל, באמצעות אורכי המקטעים הידועים ומשך הזמן הנמדד של כל תת-פולס.
      2. קבע את מדד העיוותים של התא כולו (wCDI), המוגדר על ידי Kim et ^al.2 כ:
         
         כאשר L c הוא אורך מקטע הכיווץ, ערוץ h הוא גובה הערוץ, ו- ΔT_c הוא משך _{תת-ההתכווצות}.
   3. זהה את זמן ההתאוששות של התא מעיוות, המוגדר כתת-ההתאוששות הראשון עם משרעת בטווח של 8% מהמשרעת הממוצעת מתת-העוצמה².
   4. חשב את העיוות הרוחבי של התא בתוך מקטע הכיווץ.
      1. חשב את הקוטר האפקטיבי של מקטע הכיווץ (D_e,c) כפי שהוגדר על ידי Kim et al.2: , כאשר w c הוא רוחב מקטע הכיווץ ו-_{w np} הוא הרוחב של כל המקטעים האחרים.
      2. חשב את הקוטר הכדורי המקביל d_c של התא בתוך הכיווץ על ידי שימוש חוזר במשוואה שהוגדרה על ידי Deblois ו- Bean²⁴:
         
         כאשר ΔI c/I c הוא היחס בין משרעת תת-פולס לזרם בסיסי בתת-הכיווץ ו-L_c הוא אורך מקטע הכיווץ.
      3. חישוב אורך ההתארכות של התא _{L מעוות} כפי שתואר על ידי Kim et al.2:
         
      4. לבסוף, מחשב את העיוות הרוחבי של התא δ_מעוות, המוגדר על ידי Kim et al.2 להיות .

תוצאות

פלטפורמת המכנופנוטיפינג המוצגת כאן היא גישה פשוטה ורב-תכליתית למדידת התכונות הביופיזיות של תאים בודדים עם תפוקה מתונה. תאים מוזרמים דרך התעלה המיקרופלואידית (איור 1A) באמצעות זרימה מונעת לחץ קבוע. כאשר התאים עוברים, אורך התעלה המיקרופלואידית והפולסים הנוכחיים המיוצרים נר...

Discussion

מדידת התכונות המכניות של תאים בודדים באמצעות טכניקת מכנופנוטיפינג זו מורכבת משלושה שלבים: ייצור מכשירים, איסוף נתונים וניתוח נתונים. בתוך כל שלב, ישנם היבטים בולטים שעשויים להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי. במהלך ייצור התקנים, גיאומטריות ערוצים עקביות ואחידות בין התקן להתקן חיוניים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	J.T. Baker	5356-05	Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil	n/a	n/a
Analog Low-Pass Filter	ThorLabs	EF504	≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch	Integra Miltex	33-31AA-P/25	1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade	n/a	n/a
BNC Cable	Pomona Electronics	2249-C-12	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab	Thermo Fisher Scientific	18383	https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier	DL Instruments	1211	https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419
Custom PCB (w/ components)	n/a	n/a	see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block	National Instruments	BNC-2120	https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable	National Instruments	SHC68-68-EPM	https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ)	National Instruments	PCI-6251	https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator	Thermo Fisher Scientific	5311-0250	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter	Pomona Electronics	72909	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	89510-186	https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter	Chemglass	CG-1179-21	https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA	Transene	NC0977944	https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate	Thermo Fisher Scientific	SP131825
Isopropyl Alcohol	Spectrum Chemical	I1056-4LTPL	Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure	Hammond Manufacturing	EJ12126	https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist	DuPont	n/a	https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask	Fineline Imaging	n/a	Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide	Fisher Scientific	12-553-5B	Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish	Thermo Fisher Scientific	FB0875712	100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller	Fluigent	MFCS-EZ	https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software	Fluigent	MAESFLO
Programming & Computation Software	MATLAB	R2021b	for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing	Cole Parmer	06417-31	0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter	Millapore Sigma	PHCC20060	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer	Wafer World	2885	76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater	n/a	n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane	Dow Chemical	4019862	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape	Scotch	810-341296	https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold	n/a	n/a
Triple Output Power Supply	Keysight	E36311A	https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner	Karl Suss America	MJB3 Mask Aligner