Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Özet

Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.

Özet

Hücresel mekanik özellikler, kök hücre farklılaşmasından kanser metastazına kadar çok çeşitli biyolojik süreçlerde ve hastalıklarda rol oynar. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve mikropipet aspirasyonu (MA) gibi bu özellikleri ölçmek için kullanılan geleneksel yöntemler, bir hücrenin tam viskoelastik tepkisini yansıtan zengin bilgileri yakalar; ancak, bu yöntemler çok düşük aktarım hızı ile sınırlıdır. Gerçek zamanlı deforme olabilirlik sitometrisi (RT-DC) gibi yüksek verimli yaklaşımlar, genellikle yalnızca bir hücrenin elastik özelliklerini yansıtan tek parametreli okumalarla sınırlı olduklarından, yalnızca sınırlı mekanik bilgileri ölçebilir. Bu yöntemlerin aksine, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS), orta verime sahip bir hücrenin çok parametreli viskoelastik ölçümlerini elde etmedeki boşluğu dolduran esnek, etiketsiz bir mikroakışkan platformdur. Doğru akım (DC) ölçümü, hücreleri mikroakışkan bir kanaldan geçerken izlemek, dar bir daralmadan önce, sırasında ve sonrasında boyutlarını ve hızlarını izlemek için kullanılır. Bu bilgi (yani, boyut ve hız), her hücrenin enine deformasyonunu, deformasyona karşı direncini ve deformasyondan iyileşmesini ölçmek için kullanılır. Genel olarak, bu elektronik tabanlı mikroakışkan platform, çoklu viskoelastik hücre özellikleri ve böylece bir hücrenin mekanik durumunun daha eksiksiz bir resmini sağlar. Minimum numune hazırlama gerektirdiğinden, basit bir elektronik ölçüm kullandığından (yüksek hızlı bir kameranın aksine) ve standart yumuşak litografi imalatından yararlandığından, bu platformun uygulanması basit, erişilebilir ve aşağı akış analizine uyarlanabilir. Bu platformun esnekliği, kullanışlılığı ve hassasiyeti, temel bilim ve klinik teşhiste daha birçok uygulama potansiyeli ile çeşitli hücreler hakkında benzersiz mekanik bilgiler sağlamıştır.

Giriş

Tek hücreler dinamik, viskoelastik malzemelerdir¹. Çok sayıda iç ve dış süreç (örneğin, mitozun başlangıcı veya hücre dışı matrisin [ECM] yeniden şekillendirilmesi), yapılarını ve kompozisyonlarını^{etkiler 2,3,4,} genellikle mevcut durumlarını tamamlayan farklı biyofiziksel özelliklerle sonuçlanır. Özellikle, mekanik özelliklerin hücresel gelişim, fizyoloji ve patolojinin önemli biyobelirteçleri olduğu ve kanonik moleküler ve genetik yaklaşımları destekleyebilecek değerli nicel bilgiler sağladığı gösterilmiştir ^5,6,7. Örneğin, Li ve ark. yakın zamanda ilaca dirençli ve ilaca duyarlı akut promiyelositik lösemi hücreleri arasındaki mekanik farklılıkları tanımlarken, aynı zamanda farklı şekilde eksprese edilen sitoiskeletle ilişkili genleri ortaya çıkarmak için RNA-seq kullanmışlardır⁸. Tek hücreli mekanik ve hücresel fonksiyon arasındaki karmaşık etkileşimi anlayarak, mekanofenotiplemenin temel bilim ve klinik teşhisin dönüştürülmesinde daha geniş uygulamaları vardır⁹.

Tek hücreli mekaniği ölçmek için en yaygın olarak benimsenen araç atomik kuvvet mikroskobudur (AFM). AFM, hücresel mekanik özelliklerin yüksek çözünürlüklü, lokalize bir ölçümünü mümkün kılarken, 0,01 hücre / s¹⁰ < bir verim ile sınırlı kalır. Alternatif olarak, asılı tek hücreleri 11 yakalamak ve deforme etmek için iki farklı lazer ışını kullanan optik sedyeler,^<1 hücre / s^12'nin marjinal olarak daha yüksek verimleriyle sınırlıdır. Mikroakışkan teknolojilerindeki son gelişmeler, hızlı, tek hücreli, mekanik değerlendirme için yeni nesil cihazları mümkün kılmıştır^12,13. Bu teknikler,^10-1.000 hücre / s 18 veriminde hücreleri hızlı bir şekilde deforme etmek için dar daralma kanalları 14,15, kesme akışı 16 veya hidrodinamik germe ¹⁷ kullanır. Bu yaklaşımların ölçüm oranı geleneksel tekniklerden oldukça hızlı olsa da, genellikle sınırlı mekanik okumalar için yüksek verimli yetenekler ticareti yaparlar (Ek Tablo 1). Yukarıda belirtilen tüm hızlı mikroakışkan yöntemler, yalnızca bir hücrenin elastik özelliklerini yansıtan geçiş süresi veya deforme olabilirlik oranları gibi temel, tek parametreli metriklere odaklanır. Bununla birlikte, tek hücrelerin içsel viskoelastik doğası göz önüne alındığında, hücrelerin sağlam ve kapsamlı bir mekanik karakterizasyonu, sadece elastik bileşenlerin değil, aynı zamanda viskoz tepkilerin de dikkate alınmasını gerektirir.

Mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS)^2,8 (Şekil 1A), tek hücreli mekanofenotipleme ile mevcut sınırlamaları ele alan mikroakışkan bir platformdur. Bu yöntem, hücre çapı, bağıl deforme edilebilirlik ve deformasyondan geri kazanım süresi de dahil olmak üzere çoklu biyofiziksel parametrelerin aynı anda ölçülmesini sağlar ve 1-10 hücre/sn ılımlı bir verime sahiptir. Bu teknik, düğüm-gözenek algılama (NPS) 19,20,21,22,23,24 dayanmaktadır; bu^, "düğümler" olarak adlandırılan daha geniş bölgeler tarafından bölümlere ayrılmış bir mikroakışkan kanaldan geçen bir hücre tarafından üretilen modüle edilmiş akım darbesini ölçmek için dört noktalı bir prob ölçümü kullanılmasını içerir. Modüle edilmiş akım darbesi, hücrenin segmentlerdeki (yani "gözenekler") ve düğümlerdeki akım akışını kısmen bloke etmesinin bir sonucudur ve birincisinde ikincisinden daha fazla akım bloke edilir. Mekano-NPS'de, bir segment, "kasılma kanalı", bir hücre çapından daha dardır; Sonuç olarak, bir hücrenin tüm kanalı geçmek için deforme olması gerekir (Şekil 1B). Hücre çapı, hücre kasılma kanalından önce düğüm gözeneklerini geçtiğinde üretilen alt darbenin büyüklüğü ile belirlenebilir (Şekil 1B, C). Burada, |ΔI_np|, hücre gözenekteyken geçerli düşüş, hücrenin gözenek içindeki hacim oranıyla orantılıdır, V _hücresi / V_gözenek ^2,8,19. Hücre sertliği, hücre kasılma kanalını geçtiğinde üretilen önemli ölçüde daha büyük alt darbenin süresi olanΔ T c ile belirlenebilir (Şekil 1B_, C). Daha sert bir hücrenin kanalı geçmesi daha yumuşak bir hücreden^daha uzun sürecektir ^2,8. Son olarak, hücrenin deformasyon sonrası orijinal boyutuna ve şekline dönme kabiliyeti olan hücre "geri kazanımı", hücre kasılma kanalından sonra düğüm gözeneklerini geçerken üretilen alt darbeler dizisi ile belirlenebilir (Şekil 1B, C). İyileşme süresi, ΔT_r, mevcut alt darbelerin, hücre sıkıştırılmadan önce önceki alt darbelerin büyüklüğüne dönmesi için geçen süredir. Genel olarak, bir hücrenin mikroakışkan kanaldan geçişi olarak üretilen modüle edilmiş akım darbeleri, ilgili tek hücreli mekanik parametreleri çıkarmak için kaydedilir ve analiz edilir (Şekil 1D)^2,8.

Bu elektronik tabanlı mikroakışkan platformun tekrarlanabilirliği ve kullanım kolaylığı daha önce gösterilmiştir²⁵. Ek olarak, platform tek hücreli mekanofenotipleme için giriş için düşük bir engel sunar. Mikroakışkan cihazları imal etmek için standart yumuşak litografi kullanılır. Ölçüm donanımı, basit bir baskılı devre kartı (PCB), güç kaynağı, ön amplifikatör, veri toplama kartı (DAQ) ve bilgisayar dahil olmak üzere ucuz bileşenlerden oluşur. Son olarak, veri toplama ve analizi için kullanıcı dostu kod mevcuttur ve bu da basit bir uygulama sağlar. Bu mekanofenotipleme tekniği, malign olmayan ve malign meme ve akciğer epitel hücre hatlarının popülasyonlarını ayırt edebilir, primer insan meme epitel hücrelerinde alt soylar arasında ayrım yapabilir ve sitoiskelet pertürbasyonlarının ve diğer farmakolojik ajanların etkilerini karakterize edebilir ^2,8. Genel olarak, bu platform tek hücrelerin mekanofenotiplenmesi için etkili bir yaklaşımdır.

Protokol

1. Tasarım cihazı geometrisi

1. Boyutlandırma ve geri kazanım segmentlerinin genişliğini, ölçülecek en büyük hücrelerin çapından daha geniş olacak şekilde seçin, ancak aynı zamanda yeterli bir sinyal-gürültü oranını (SNR) korur. Çeşitli hücre satırları için farklı boyutlandırma ve kurtarma segmenti genişliklerine örnekler için Ek Tablo 2'ye bakın.
2. Mekanofenotiplemeye tabi tutulacak hücrelerin ortalama boyutuna %30-%40'lık bir gerinim uygulamak için büzülme segmenti genişliğini seçin. Gerinim, d'nin hücre çapı ve w_c'nin büzülme kanalı genişliği ^2,8 olduğu durumlarda tanımlanır. Çeşitli hücre hatları için farklı büzülme segmenti genişlikleri için Ek Tablo 2'ye bakın.
   NOT: Önemli ölçüde farklı çaplara sahip hücre tiplerini veya koşullarını karşılaştırmak istenirse, her hücre tipine / durumuna özgü büzülme segmenti genişlikleriyle ayrı cihaz tasarımları kullanılmalıdır.
3. Her benzersiz cihaz geometrisi için bir referans cihaz tasarlayın. Bu, mikroakışkan kanalın boyutlandırma gözenek segmentinin etkili çapı olan D_e'yi belirlemek için gereklidir.
   NOT: Referans cihaz, birincil cihazla aynı geometriyi kullanır. Tek değişiklik, büzülme segmentinin, bilinen bir boyuttaki polistiren boncuklarla kalibrasyona izin vermek için boyutlandırma gözenek segmentine genişlikte eşit olması gerektiğidir. Kasılmanın genişletilmesi, polistiren boncukların kalibrasyon sırasında kasılma kanalını tıkamasını önler. Kalibrasyon işlemi 4.1 ve 5.3.1 numaralı adımlarda daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kalibrasyon, piyasada satılan bir hücre sayacı kullanılarak da gerçekleştirilebilir, bu durumda referans cihazına gerek yoktur. Bu işlem adım 4.2'de açıklanmıştır.
4. Kanal yüksekliğini, ilgilenilen en büyük hücrelerin büzülme segmenti² içinde kısıtlama olmaksızın tamamen uzayabileceği şekilde seçin. Kanal yüksekliğinin h_min'den daha büyük olduğundan emin olun (bu, hücrenin küresel ön deformasyon olduğunu ve deformasyon sırasında kanal uzunluğu ve yüksekliği boyunca izometrik deformasyonun meydana geldiğini varsayar).
   NOT: Bir akım alt darbesinin büyüklüğü göz önüne alındığında, h_min ne kadar büyükse, genel SNR o kadar düşük olacaktır.
5. Seçilen kanal genişliklerine sahip bilgisayar destekli tasarım yazılımını kullanarak bir fotoğraf maskesi tasarlayın ve oluşturun. Ek Dosya 1'de örnek bir dosya verilmiştir. Negatif master'dan soyulduktan sonra polidimetilsiloksan (PDMS) büzülmesini hesaba katmak için mikroakışkan maske tasarımını% 1,5 oranında ölçeklendirin.
   NOT: Bir dizi cihaz, genel dizi gofret boyutunu aşmadığı sürece tek bir maskeye dahil edilebilir (Ek Şekil 1A).
6. Mikroakışkan cihaz akımının dört noktalı prob ölçümünü gerçekleştirmek için kullanılacak elektrotlarla bir fotomaske tasarlayın ve oluşturun (Şekil 1D). Ek Dosya 1'de örnek bir dosya verilmiştir.
   NOT: Bir elektrot dizisi, dizi cam kızağın boyutunu aşmadığı sürece tek bir maskeye dahil edilebilir (Ek Şekil 1B).

2. Fabrikasyon cihazları (Şekil 2)

1. Bir cam substrat üzerinde elektrot desenleri hazırlayın.
   1. Pozitif bir fotodirenci düz cam bir slayt üzerine ürün veri sayfasına göre püskürtün, desenleyin ve işleyin. Bu yordamın bir örneği Ek Dosya 2'de özetlenmiştir.
   2. Metal biriktirme, kaldırma ve altın aşındırma işlemlerini gerçekleştirin.
      1. Slayta 75 şTi, 250 şPt ve 250 şAu ince film biriktirme işlemi gerçekleştirin. Elektron tabancası buharlaşmasını kullanan bu prosedürün bir örneği Ek Dosya 3'te özetlenmiştir.
      2. Fazla metalin kaldırılmasını gerçekleştirmek için slaytı 15 dakika boyunca asetona batırın.
      3. Bir duman davlumbazında, Ek Şekil 2'de gösterildiği gibi, mikroakışkan kanala maruz kalacak elektrotların bölgesine altın kazıntıyı dökmek için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Slaytın başka bir yerinde kazıntıların düşmesini önlemek için dikkatli olun.
         DİKKAT: Altın kazıma cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Buharları solumayın ve yutmayın. Dikkatli kullanın, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin ve yerel bertaraf yönetmeliklerine göre atıkları atın.
      4. Slaytı deiyonize (DI) suyla durulayın ve kuru azotla (_N2) kurulayın.
   3. Aynı cam slayta birden fazla elektrot basılmışsa, slaytı tek tek yongalara doğrayın.
      1. Desenli elektrot sınırları boyunca slaytı puanlamak için bir cam kesici alet kullanın.
      2. Slaytı tek tek yongalara bölmek için camı skor boyunca kırın.
   4. Elektrotları mikroskop altında görsel olarak inceleyin. Tek tek elektrotların elektriksel olarak açık olmadığından veya elektrotların birlikte kısaltılmadığından emin olun.
2. Kanallar için negatif bir ana kalıp imal edin.
   1. Ürün veri sayfasına göre bir SU-8 epoksi direncini cilalı bir silikon gofret üzerine döndürün, desenleyin ve işleyin. Bu yordamın bir örneği Ek Dosya 2'de özetlenmiştir.
   2. Bir profilometre kullanarak özellik yüksekliklerini ölçün ve özellikleri mikroskop altında görsel olarak inceleyin (Ek Şekil 3). İstenilen geometrilerin iyi tanımlandığından emin olun.
3. Yumuşak litografi ile kalıp PDMS kanalları.
   1. Tek kullanımlık bir kapta bir elastomer ve bir çapraz bağlayıcıyı 10:1 kütle oranında tartarak PDMS'yi hazırlayın.
      NOT: Çapı 3 olan bir gofret için 30 g PDMS yeterlidir.
   2. PDMS kabarcıklarla opak olana kadar PDMS'yi tek kullanımlık bir çatalla 30 saniye boyunca kuvvetlice karıştırın.
   3. PDMS'yi bir vakum odasında yaklaşık 30-90 dakika boyunca veya PDMS görünür kabarcıklar olmadan şeffaf hale gelene kadar gazdan arındırın.
   4. Gofreti SU-8 ana kalıbı ile tek kullanımlık bir Petri kabına yerleştirin ve PDMS'yi gofretin ortasına dökün.
   5. PDMS ve gofret içeren Petri kabını bir vakum odasına yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika boyunca veya PDMS'de kabarcık kalmayana kadar gazı çözün.
   6. PDMS'yi 80 °C'de bir fırında veya sıcak plakada 2 saat pişirin.
   7. Keskin bir bıçakla, PDMS'yi SU-8 negatif master'dan kesin ve çıkarın.
   8. Kalıplanmış PDMS levhayı keskin bir bıçak kullanarak ayrı kalıplara doğrayın
   9. Giriş ve çıkış erişim deliklerini tek kullanımlık bir biyopsi zımbalama kullanarak çekirdek oluşturun. En iyi sonuçları elde etmek için, her PDMS levhası için yeni bir zımba kullanın. Daha keskin bir zımba, pürüzsüz kenarlı delikler üreterek büzülme kanalını engelleyebilecek partikülleri en aza indirir.
      NOT: Erişim deliklerinin çapı, borunun dış çapından biraz daha az olmalıdır. Örneğin, dış çapı 1/32 inç olan politetrafloroetilen (PTFE) boru kullanılıyorsa, 1,5 mm'lik bir delik açılmalıdır.
4. PDMS kanallarına bir cam/elektrot substratı bağlayın.
   1. Elektrot camı kızaklarını metanol ile temizleyin (≥% 99.8). Kuru N_{2 ile kurulayın}.
   2. PDMS cihazını viski bandı ile temizleyin, ardından izopropil alkol (IPA) ve deiyonize su (DI; 18 MΩ /^cm2) ile durulayın. Kuru N_{2 ile kurulayın}. Ardından, viski bandı ile bir kez daha temizleyin.
   3. Cam substratı prefabrik elektrotlarla ve hazırlanan PDMS kalıbıyla (özellik tarafı yukarı) bir plazma temizleyiciye yerleştirin.
   4. Her ikisini de 2 dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın (100-300 mTorr, 30 W).
   5. PDMS kalıbını, özellik tarafı aşağı bakacak şekilde hizalayın ve prefabrik elektrotlarla cam alt tabakanın üzerine yerleştirin.
      NOT: Plazma ile işlenmiş PDMS ve cam temas ettiğinde yapıştırma anlıktır; sonuç olarak, daha fazla hizalama modifikasyonu mümkün olmayacaktır. Hizalamayı kolaylaştırmak için, DI suyundaki 2: 1 metanolün 20 μL'lik seyreltilmesi, plazma ile muamele edilmiş cam yüzeye pipetlenebilir. Metanol çözeltisi, işlenmiş cam ve PDMS arasında fiziksel bir bariyer görevi görerek hizalama ayarlamalarına izin verir. Metanol kullanıyorsanız, çözeltiyi buharlaştırmak ve yapıştırma işlemini tamamlamak için hizalanmış ve çiftleştirilmiş cihazı 50 ° C'de 2 saat pişirin.
   6. Bağlı cihazı mikroskop altında görsel olarak inceleyin. Elektrotların ve kanal geometrilerinin düzgün bir şekilde hizalandığından emin olun.

3. Hücreleri ölçün (Şekil 1D)

1. Basınç kaynağını, PCB'yi, tezgah üstü donanımı ve veri toplama yazılımını hazırlayın.
   1. Kelepçeyi kullanarak mikroakışkan cihazı PCB'ye bağlayın. PCB'nin bir örneği Ek Dosya 4'te (GERBER dosyaları) ve Ek Dosya 5'te (şematik, kart ve PCB parça listesi dosyaları) verilmiştir.
      1. Kelepçenin yaylı pimlerini mikroakışkan cihazdaki elektrot temas pedleriyle hizalayın ve kelepçenin başlık pimlerini PCB üzerindeki deliklerle hizalayın.
      2. Kelepçenin başlık pimlerini PCB deliklerine sıkıca yerleştirerek yaylı pimlerin elektrot temas pedleriyle aynı hizada kalmasını sağlayın.
   2. Elektronik donanımı kurun ve bağlayın.
      1. Güç kaynağının çıkış bağlantı noktalarından ikisini, çift muz fişli Bayonet Neill-Concelman (BNC) dişi adaptörü ve BNC kablosuyla PCB'nin besleme voltajı bağlantı noktasına bağlayın.
      2. Güç kaynağını açın. BNC'nin iç iletkenine bağlı çıkışı +15 V'a ayarlayın ve diğer çıkışı -15 V'a ayarlayın.
      3. Güç kaynağının çıkış bağlantı noktalarının üçüncüsünü BNC kablosuyla PCB'nin giriş voltajı bağlantı noktasına bağlayın. Çıkışı istenen uygulanan voltaja ayarlayın, ancak deneye başlayana kadar etkinleştirmeyin.
      4. PCB'nin çıkış akımı portunu bir BNC kablosuyla akım ön amplifikatörünün girişine bağlayın.
      5. Mevcut ön amplifikatörün çıkışını, bir BNC kablosuyla veri toplama sisteminin BNC terminal bloğundaki bir analog girişe bağlayın. İsteğe bağlı olarak, yüksek frekanslı paraziti filtrelemek için BNC kablosuyla aynı hizada bir analog alçak geçirgen filtre bağlayın.
         NOT: SNR'yi iyileştirmek için, PCB ve cihaz kalın bir metal muhafaza içine yerleştirilebilir. Tüm BNC kabloları ve akışkan borular, muhafazaya açılan deliklerden yönlendirilebilir.
   3. Gerekli yazılımı kişisel bilgisayara (PC) yükleyin ve kurun
      1. Basınç kontrol cihazını açın ve PC'ye bağlayın. Gerekli tüm basınç kontrol cihazı yazılımlarını üreticinin talimatlarına göre kurun.
      2. MATLAB'ı ve Veri Toplama Araç Kutusu'nu PC'ye yükleyin. MATLAB Veri Toplama Araç Kutusu arabiriminin algılayabilmesi için veri toplama sistemi için gerekli sürücülerin yüklendiğinden emin olun.
      3. Birlikte verilen veri toplama komut dosyası "NPS.m"yi https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public'dan indirin.
   4. Veri alma komut dosyasını açın ve yapılandırın.
      1. Satıcı Kimliği, DAQ'ın Cihaz Kimliği ve analog giriş kanalı numarasını (dahil edilen komut dosyasında 34-36. satırlar) içeren veri toplama oturumunu başlatmak için doğru değerleri ayarlayın.
         NOT: Cihaz Kimliği, "daq.getDevices" veya "daqlist" işlevi kullanılarak bulunabilir.
      2. Edinme için istenen örnekleme hızını ayarlayın (dahil edilen komut dosyasında satır 23). En iyi sonuçlar için en az 10 kHz'e ayarlanmalıdır.
2. Hücre süspansiyonunu hazırlayın.
   1. 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2'lik bir fetal sığır serumu (FBS) çözeltisi hazırlayın ve 0.22 μm filtre ile filtreleyin.
   2. Hücreleri kültüre alır ve tercih edilen hücre hattının uygun hücre kültürü protokolüne göre hazırlar. Hazırlanan %2 FBS çözeltisindeki hücreleri, 1-5 x 10^{5 hücre/} mL konsantrasyonda 1x PBS içinde askıya alın. Deney süresince hücreleri buz üzerinde tutun.
3. Hücrelerin fiziksel özelliklerini ölçün.
   1. Hücre örneğini boruya yükleyin ve cihaz girişine bağlayın.
      1. 30 cm'lik PTFE borusunu tıraş bıçağı veya keskin bıçakla kesin.
      2. Borunun bir ucunu bir luer kilit şırıngasına takın. Hücre örneğini borunun diğer ucuna çekmek için şırıngayı kullanın.
      3. Boruyu cihazın girişine dikkatlice yerleştirin.
      4. Borunun karşı ucunu mikroakışkan basınç kontrol cihazına bağlayın.
         NOT: Basınç kontrolörüne sıvı geri akışını önlemek için mikroakışkan basınç kontrolörü ile boru arasına bir filtre eklenebilir.
   2. Denemeyi çalıştırın.
      1. Basınç kontrol cihazı yazılımı üzerinde istenen sabit sürüş basıncını ayarlayın ve numunenin cihazı doldurmasına izin verin.
         NOT: Basınç tipik olarak 2-21 kPa'dır. Akış hızı, açıkça tanımlanmış darbelere izin verecek kadar yavaş, ancak yeterli verime izin verecek kadar hızlı olmalıdır.
         1. Mikroakışkan kanallarda kabarcıklar oluşursa, çıkmaz doldurma kullanın: cihaz çıkışını takın ve gaz geçirgen PDMS'den havayı dışarı çıkmaya zorlamak için girişe düşük bir basınç uygulayın. Kanalda kabarcıklar bırakmak, dengesiz bir akım taban çizgisine yol açacak ve doğru ölçümleri önleyecektir.
         2. Enkaz mikroakışkan kanalı tıkarsa, sürüş basıncını uygularken PDMS cihazının üstüne hafifçe bastırarak, basıncı açıp kapatarak veya boruyu çıkarıp yeniden yerleştirerek daha yüksek bir basıncı "darbeleyerek" yerinden çıkarın. Enkaz kalırsa, yeni bir cihaza geçmek gerekebilir.
      2. Güç kaynağındaki Voltaj düğmesini döndürerek istediğiniz voltajı ayarlayın ve Açma düğmesine basarak voltajı etkinleştirin.
         NOT: Voltaj tipik olarak 1-5 V'tur. Yeterli bir SNR için gereken en düşük voltajı seçin. Karşılaştırılacak tüm koşullarda aynı voltaj kullanılmalıdır.
      3. Mevcut ön amplifikatörü açın ve hassasiyeti (A / V) mümkün olduğunca düşük ayarlayın; alternatif olarak, ön amplifikatörü aşırı yüklemeden veya DAQ'nın maksimum analog giriş voltajını aşmadan kazancı (V / A) mümkün olduğunca yükseğe ayarlayın. Bu çalışmada duyarlılık ^10-7 A/V olarak ayarlandı.
         NOT: Uygun hassasiyet/kazanç değeri, hem uygulanan voltaja hem de mikroakışkan kanalın temel direncine bağlı olacaktır.
      4. NPS.m veri toplama komut dosyasını başlatmak ve verileri örneklemeye ve kaydetmeye başlamak için MATLAB şerit menüsündeki yeşil Çalıştır düğmesine basın.
      5. Denemeyi sonlandırmak için, veri toplama komut dosyasını durdurmak üzere şekil penceresinin sol alt köşesindeki Durdur düğmesine basın. Açık düğmesine basarak güç kaynağı çıkışını devre dışı bırakın. Basınç kontrol cihazı yazılımında basınç kaynağını sıfır basınca ayarlayın.
      6. Bu noktada, deneme aşağıdakilerden birini veya birkaçını yapmak için duraklatılabilir:
         1. Mevcut cihazı yenisiyle değiştirin.
         2. Boruyu daha fazla hücre örneğiyle yeniden yükleyin.
            NOT: Numunenin çapraz kontaminasyonunu önlemek için, farklı tipteki veya koşullardaki hücreleri ölçmek üzere yeni cihazlar kullanın.
         3. Cihazı PCB'den çıkarın ve kanalın durumunu mikroskop altında inceleyin. Aynı cihazı kullanarak deneyi yeniden başlatmak için, hava kabarcıklarının ortaya çıkmamasına dikkat edilmelidir. Hücre örneğini cihaz girişine yerleştirirken tüpün en sonunda tutmak için şırınga pistonuna hafif basınç uygulamak gerekebilir.

4. Mikroakışkan cihazı kalibre edin

1. 1. Seçenek: Referans cihazlardaki polistiren boncukları ölçün.
   1. Boyutlandırma kanalından daha küçük bir polistiren boncuk boyutu seçin.
   2. Hücre deneyleri sırasında kullanılan filtrelenmiş PBS ve FBS çözeltisine, 1-3 x 10 5 boncuk / mL konsantrasyonunda%^1,5 Ara ve polistiren boncuklar ekleyin.
   3. Bölüm 3'te belirtildiği gibi, adım 1.3'te açıklanan referans cihazı kullanarak deneye devam edin ve deneme sırasında kullanılan voltajın aynısını uygulayın. Bölüm 5'te açıklandığı gibi, boncuklar boyutlandırma gözeneklerini geçerken üretilen mevcut düşüşün ortalama büyüklüğünü ve D _e'yi hesaplamak için boncukların bilinen çapını kullanın.
2. 2. Seçenek: Hücre boyutunu ayrı bir ölçüm cihazıyla bağımsız olarak ölçün.
   1. Adım 4.1'deki protokolü takip etmek yerine, numunedeki hücrelerin ortalama boyutunu ölçmek için ticari olarak temin edilebilen bir hücre boyutu ölçüm cihazı kullanın. Bu durumda, referans cihazına gerek yoktur. Bölüm 5'te açıklandığı gibi D e'yi hesaplamak için hücreler boyutlandırma gözeneklerini ve ölçülen ortalama hücre çapını geçerken üretilen ortalama akım düşüşünü kullanın.

5. Hücre fenotiplerini çıkarmak için verileri analiz edin

NOT: Veri işleme, mNPS_procJOVE https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE.m adresindeki MATLAB komut satırı arabirim program dosyası kullanılarak gerçekleştirilebilir. Daha fazla talimat için Ek Dosya 6'ya bakın.

1. Verileri önceden işleyin (Şekil 3A).
   1. Akım-gerilim preamplifikatöründe kullanılan kazanç değerini DAQ tarafından elde edilen ham verilere uygulayarak ölçülen elektrik akımını hesaplayın.
   2. Ham akım ölçümüne dikdörtgen yumuşatma fonksiyonu ve/veya alçak geçirgen filtre uygulayarak yüksek frekanslı gürültüyü giderin. Ardından, filtrelenen verileri daha düşük bir örnekleme hızına yeniden örnekleyin. Ayrıca, karşılık gelen zaman damgası verilerini bu düşük örnekleme hızında hesaplayın.
   3. ^26'yı yumuşatan asimetrik en küçük kareler gibi bir yöntem uygulayarak takılı bir taban çizgisi akım sinyalini hesaplayın.
   4. Sonraki veri noktaları arasındaki farkı alarak önceden işlenmiş geçerli verilerin yaklaşık ilk türevini (fark sinyali) hesaplayın.
2. Hücre olaylarını tanımlayın ve alt darbe verilerini ayıklayın (Şekil 3B).
   1. Önceden işlenmiş verileri inceleyerek aday hücre olaylarını arayın. Diğer hücre olaylarıyla (yani, tesadüf olayları) çakışan hücre olaylarını reddedin (Ek Şekil 4), zayıf bir taban çizgisi uyumu sergileyen veya beklenmeyen ya da hatalı bir darbe şekline sahip olan (örneğin, kanalda bir tıkanıklık mevcut olabilir).
   2. Her hücre olayı için alt darbe verilerini ayıklayın.
      1. Her düğüm-gözenek segmenti, genel sinyal darbesi içinde karşılık gelen bir alt darbe olarak görünecektir (Şekil 1B, C). Fark sinyali yerel bir minimum değere ulaştığında zaman noktasını hesaplayarak her bir alt darbenin başlangıcını tanımlayın. Fark sinyali yerel bir maksimum değere ulaştığında zaman noktasını hesaplayarak her bir alt darbenin sonunu tanımlayın.
      2. Her bir alt darbenin genişliğini, başlangıç ve bitiş zaman noktaları arasında geçen süre olarak belirleyin. Başlangıç ve bitiş zaman noktaları arasındaki tüm veri noktaları için ölçülen akım ile taban çizgisi akımı arasındaki farkın ortalamasını hesaplayarak her bir alt darbenin genliğini belirleyin.
3. Alt darbe verilerine dayanarak her hücre olayı için hücre mekanofenotipini belirleyin.
   1. Deblois ve Bean²⁴ tarafından tanımlanan denkleme dayanarak d hücre çapını belirleyin:
      
      burada ΔI / I , boyutlandırma alt darbelerinde alt darbe genliğinin taban çizgisi akımına ortalama oranıdır, D_e kanalın etkin çapıdır (adım 4'te ölçülür) ve L , düğüm-gözenek kanalının toplam uzunluğudur.
      1. D e, bilinen bir çaptaki (hücreler veya boncuklar, bkz. adım 4) bir dizi parçacık tarafından üretilen ortalama ΔI / I'nin hesaplanmasıyla, bilinen çapı d olarak kullanarak ve D_e için Eq 1'i çözerek belirlenir_.
   2. Hücrenin deformasyona karşı direncini ölçün.
      1. Bilinen segment uzunluklarını ve her bir alt darbenin ölçülen süresini kullanarak, boyutlandırma alt darbelerindeki ortalama hücre hızını hesaplayarak akışkan hızı U_akışını belirleyin.
      2. Kim ve ^ark.2 tarafından tanımlanan tüm hücre deforme edilebilirlik indeksini (wCDI) belirleyin:
         
         burada L_c , büzülme segmentinin uzunluğu, h_kanalı kanal yüksekliği ve ΔT_c , büzülme alt darbesinin süresidir.
   3. Hücrenin, boyutlandırma alt darbesi^2'den ortalama genliğin% 8'inde bir genliğe sahip ilk kurtarma alt darbesi olarak tanımlanan deformasyondan iyileşme süresini tanımlayın.
   4. Kasılma segmenti içindeki hücrenin enine deformasyonunu hesaplayın.
      1. Kim ve ^ark.2 tarafından tanımlandığı gibi büzülme segmentinin (D_e,c) etkin çapını hesaplayın: burada w _c, büzülme segmentinin genişliğidir ve w_np, diğer tüm segmentlerin genişliğidir.
      2. Kasılma içindeki hücrenin eşdeğer küresel çapını d c'yi, Deblois ve Bean²⁴ tarafından tanımlanan denklemi kullanarak tekrar hesaplayın:
         
         burada ΔI c/I c, büzülme alt darbesindeki alt darbe genliğinin temel akıma oranıdır ve L_c, büzülme segmentinin uzunluğudur.
      3. Kim ve ^ark.2 tarafından açıklandığı gibi hücrenin uzama uzunluğu L'nin_deforme olduğunu hesaplayın:
         
      4. Son olarak, hücrenin enine deformasyonunu hesaplayın δ Kim ve ^ark.2 tarafından tanımlanan _deforme .

Sonuçlar

Burada sunulan mekanofenotipleme platformu, orta verime sahip tek hücrelerin biyofiziksel özelliklerini ölçmek için basit ve çok yönlü bir yaklaşımdır. Hücreler, sabit basınç güdümlü akış kullanılarak mikroakışkan kanaldan (Şekil 1A) akar. Hücreler geçiş yaparken, mikroakışkan kanalın uzunluğu ve üretilen akım darbeleri, veri toplama donanımı kullanılarak kaydedilir. Elde edilen sinyal (Şekil 1B, C) daha sonra...

Tartışmalar

Bu mekanofenotipleme tekniğini kullanarak tek hücrelerin mekanik özelliklerinin ölçülmesi üç aşamadan oluşur: cihaz üretimi, veri toplama ve veri analizi. Her aşamada, deneysel sonuçları önemli ölçüde etkileyebilecek dikkate değer yönler vardır. Cihaz üretimi sırasında, tutarlı kanal geometrileri ve cihazdan cihaza homojenlik, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar için gereklidir. Özellikle, her aygıtın yan duvarları nispeten düzgün olmalıdır (Şekil 4Ai) ve ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	J.T. Baker	5356-05	Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil	n/a	n/a
Analog Low-Pass Filter	ThorLabs	EF504	≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch	Integra Miltex	33-31AA-P/25	1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade	n/a	n/a
BNC Cable	Pomona Electronics	2249-C-12	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab	Thermo Fisher Scientific	18383	https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier	DL Instruments	1211	https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419
Custom PCB (w/ components)	n/a	n/a	see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block	National Instruments	BNC-2120	https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable	National Instruments	SHC68-68-EPM	https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ)	National Instruments	PCI-6251	https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator	Thermo Fisher Scientific	5311-0250	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter	Pomona Electronics	72909	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	89510-186	https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter	Chemglass	CG-1179-21	https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA	Transene	NC0977944	https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate	Thermo Fisher Scientific	SP131825
Isopropyl Alcohol	Spectrum Chemical	I1056-4LTPL	Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure	Hammond Manufacturing	EJ12126	https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist	DuPont	n/a	https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask	Fineline Imaging	n/a	Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide	Fisher Scientific	12-553-5B	Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish	Thermo Fisher Scientific	FB0875712	100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller	Fluigent	MFCS-EZ	https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software	Fluigent	MAESFLO
Programming & Computation Software	MATLAB	R2021b	for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing	Cole Parmer	06417-31	0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter	Millapore Sigma	PHCC20060	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer	Wafer World	2885	76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater	n/a	n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane	Dow Chemical	4019862	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape	Scotch	810-341296	https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold	n/a	n/a
Triple Output Power Supply	Keysight	E36311A	https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner	Karl Suss America	MJB3 Mask Aligner