עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

היחידה הארגונית הבסיסית של הכרומטין האיקריוטי היא חלקיק הליבה הנוקלאוזומי (NCP), המורכב מדנ"א עטוף ~1.7 פעמים סביב אוקטמר היסטון. כרומטין מוגדר כישות של NCPs וקומפלקסים חלבוניים רבים אחרים, כולל גורמי שעתוק, עיצוב מחדש של כרומטין ושינוי אנזימים. עדיין לא ברור כיצד אינטראקציות חלבון-דנ"א אלה מתוזמרות ברמה של אתרים גנומיים ספציפיים במהלך שלבים שונים של מחזור התא. זה בעיקר בשל המגבלות הטכניות הנוכחיות, אשר מקשות על השגת מדידות מדויקות של אינטראקציות דינמיות כאלה. כאן, אנו מתארים שיטה משופרת המשלבת רקומבינציה ספציפית לאתר עם פרוטוקול טיהור זיקה יעיל בצעד אחד כדי לבודד מוקד גן בעל עניין בעותק יחיד במצב הכרומטין הטבעי שלו. השיטה מאפשרת העשרה איתנה של מוקד המטרה על פני כרומטין, מה שהופך טכניקה זו לאסטרטגיה יעילה לזיהוי וכימות אינטראקציות חלבונים באופן בלתי משוחד ושיטתי, למשל על ידי ספקטרומטריית מסות. בהמשך לניתוחי הרכב כאלה, כרומטין טבעי שטוהר בשיטה זו משקף ככל הנראה את המצב in vivo בנוגע למיקום נוקלאוזומים ושינויים בהיסטון, ולכן ניתן לבצע ניתוחים מבניים וביוכימיים נוספים של כרומטין הנגזר כמעט מכל מוקד גנומי בשמרים.

Introduction

הארגון הדינמי של גנומים אאוקריוטים לכרומטין דוחס את הדנ"א כך שיתאים לגבולות הגרעין תוך הבטחת דינמיקה מספקת לביטוי גנים ונגישות לגורמים רגולטוריים. בין השאר, רב-תכליתיות זו מתווכת על ידי הנוקלאוזום, היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מחלקיק ליבה עם 147 bp של DNA עטוף ~ 1.7 פעמים סביב אוקטמר היסטון¹. הנוקלאוזום, הוא מבנה דינמי מאוד ביחס להרכבו, עם גרסאות היסטון רבות ושינויים פוסט-תרגומיים (PTM) על זנבות ההיסטון N ו-C. יתר על כן, כרומטין אאוקריוטי מקיים אינטראקציה עם מספר רב של מרכיבים חיוניים אחרים, כגון גורמי שעתוק, מכונות עיבוד DNA ו- RNA, חלבונים ארכיטקטוניים, אנזימים המעורבים בעיצוב מחדש ושינוי של כרומטין, ומולקולות RNA הקשורות לכרומטין. מכונות חיוניות אלה המעורבות בשעתוק, שכפול ותיקון דורשות גישה לכרומטין, המשמש כמצע הטבעי לתהליכים אלה. כתוצאה מכך, הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עסקאות דנ"א אלה מחייבת הגדרה מדויקת של השינויים הקולקטיביים במבנה הכרומטין באזורים הגנומיים הספציפיים שבהם מכונות אלה מתכנסות ומאפשרות תגובות ביולוגיות.

למרות הזיהוי של גורמי כרומטין רבים באמצעות גנטיקה ומחקרי אינטראקציה חלבון-חלבון, ביצוע ניתוחים ישירים, בלתי משוחדים ומקיפים של אינטראקציות כרומטין באתרים גנומיים מסוימים נותר מכשול משמעותי ^2,3. בתחילה, ניתן היה לבודד רק אזורים שופעים מאוד של הגנום (כלומר, לוקי חוזר) או פלסמידים מרובי עותקים בכמויות וטוהר מספיקים לזיהוי ספקטרומטרי מסה של החלבונים הקשורים 4,5,6,7. סדרה של גישות חדשות המבוססות על הכלאה ישירה של גשושיות לכידה לדנ"א כרומטיני, ביוטינילציה של קרבה באמצעות מערכת CRISPR-dCas9, או קשירה של חלבוני מתאם ספציפיים לרצף למוקד העניין החלו לפענח את הפרוטאום של אתרים בעלי עותק יחיד מגנומים של שמרים ויונקים ^8,9,10. עם זאת, כל השיטות הללו דורשות הצלבת פורמלדהיד כדי לייצב את אינטראקציות החלבון-דנ"א וסוניקציה כדי להמיס את הכרומטין לטיהור לאחר מכן. יחד, שתי המניפולציות שוללות את האפשרות של מחקרים מבניים ופונקציונליים הבאים של הכרומטין המטוהר.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו בעבר מתודולוגיה המשתמשת ברקומבינציה ספציפית לאתר כדי לחלץ תחומים כרומוזומליים ממוקדים משמרים^11,12. בעיקרו של דבר, האזור הגנומי המעניין מוקף באתרי זיהוי (RS) עבור R-רקומבינאז ספציפי לאתר מ- Zygosaccharomyces rouxi ובו זמנית משלב קבוצה של שלושה אתרי קישור DNA עבור חלבון מדכא השעתוק הפרוקריוטי LexA (LexA) באותו אזור. תאי השמרים מכילים קסטת ביטוי לביטוי סימולטני של R-רקומבינאז וחלבון LexA המאוחה לתג טיהור זיקה טנדם (TAP). לאחר השראת R-רקומבינאז, האנזים מוציא ביעילות את אזור המטרה מהכרומוזום בצורה של תחום כרומטין מעגלי. ניתן לטהר תחום זה באמצעות חלבון מתאם LexA-TAP, הנקשר לאתרי קשירת הדנ"א של LexA, כמו גם לתמיכה באהדה. שיטה זו שימשה לאחרונה לבידוד תחומי כרומטין נפרדים המכילים מקורות שכפול נבחרים של כרומוזום שמרים III¹³.

אחד היתרונות העיקריים של גישת ex vivo זו הוא שהיא מאפשרת ניתוחים פונקציונליים של החומר המבודד. לדוגמה, תחומי מקור שכפול שטוהרו בשיטה זו יכולים להיות נתונים למבחני שכפול חוץ גופיים כדי להעריך את יעילות ירי המקור במבחנה מתבניות כרומטין מורכבות מקוריות in vivo . בסופו של דבר, האפיון הביוכימי והפונקציונלי של החומר המבודד עשוי לאפשר בנייה מחדש של תהליכים גרעיניים באמצעות חלבונים מטוהרים יחד עם תבנית הכרומטין המקורית. לסיכום, מתודולוגיה זו פותחת אפיק מרתק במחקר הכרומטין, שכן ניתן יהיה לעקוב אחר השינויים הקולקטיביים בהרכב ובמבנה הכרומטין של אזור גנומי מסוים העובר טרנזקציה כרומוזומלית מסוימת.

Protocol

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של הפתרונות, המאגרים והמדיה שבהם נעשה שימוש.

1. בניית זן שמרים רקומביננטי

1. כדי לבנות זן שמרים בעל יכולת רקומבינציה, הפוך פלסמיד K238 מעוכל SbfI לזן שמרים עם אתרי קישור משולבים של LexA ואתרי רקומבינציה RS במוקד העניין^13,14.
   הערה: מקטע הגבלת SbfI שעבר טרנספורמציה מכיל את קלטת הביטוי הנדרשת לביטוי מכונן של חלבון ההיתוך LexA-TAP ו-R-רקומבינאז יחד עם רצפים הומולוגיים של כרומוזום שמרים I לאינטגרציה גנומית של קלטת הביטוי באמצעות רקומבינציה הומולוגית (איור 1).
2. כדי לבנות זן בקרה, קחו זן שמרים איזוגני חסר אתרי קישור משולבים של RS ו-LexA, והפכו אותו לפלסמיד K238 מעוכל SbfI באותם תנאים שבהם נעשה שימוש בזן המוכשר לרקומבינציה.
3. בחר את תאי השמרים המתאימים בהתבסס על סמן הבחירה LEU2 על לוחות אגר SCD-LEU¹⁴.

2. צימוד נוגדני IgG לחרוזים מגנטיים המופעלים על ידי אפוקסי

הערה: זוג נוגדני IgG לחרוזים מגנטיים המופעלים על ידי אפוקסי על פי פרוטוקול¹¹ הבא שפורסם.

1. להשהות 300 מ"ג של חרוזים המופעלים אפוקסי ב 10 מ"ל של 50% אצטון (300 מ"ג מתאים ~ 5.1 ×¹⁰ חרוזים) בצינור חרוטי 50 מ"ל. נערו במרץ על מערבל מערבולת.
2. צנטריפוגה את הצינור המכיל את החרוזים ב 820 × גרם ו 4 ° C במשך 2 דקות. הסר את supernatant.
3. לשטוף את החרוזים 3x עם 20 מ"ל של 0.1 M נתרן פוספט חיץ (pH 7.4). הסר את הסופרנאטנט לאחר כל שלב שטיפה באמצעות צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.2.
4. מרחפים את החרוזים ב-16 מ"ל של חיץ נתרן פוספט 0.1 מ' (pH 7.4), ומסובבים בעדינות בתנור הכלאה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. להמיס את IgGs ארנב (100 מ"ג) ב 7 מ"ל של dH₂O (ריכוז סופי: 14 מ"ג / מ"ל).
6. צנטריפוגה את מתלה IgG ב 13,000 × גרם ו 4 ° C במשך 10 דקות כדי להבהיר את המתלים.
7. מעבירים 3.5 מ"ל של supernatant (המקביל 50 מ"ג של ארנב IgGs) לצינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
8. לדלל את תמיסת IgG עם 9.85 מ"ל של 0.1 M נתרן פוספט חיץ (pH 7.4), ואחריו תוספת טיפה של 6.65 מ"ל של 3 M אמוניום סולפט ב 0.1 M פוספט נתרן (pH 7.4) תחת ערבוב עדין.
   הערה: הימנע מהוספת אמוניום סולפט במהירות לתמיסה מכיוון שריכוז מקומי גבוה של המלח יגרום למשקעים של הארנב IgGs.
9. צנטריפוגו את תמיסת IgG בטמפרטורה של 820 × גרם ו-4°C למשך 3 דקות, והוסיפו את הסופרנאטנט המתקבל לתרחיף החרוזים המגנטי.
10. לדגור על הצינור למשך הלילה או לפחות למשך 18 שעות בטמפרטורה של 30°C עם סיבוב עדין בתנור הכלאה.
11. הסר את supernatant כמתואר בשלב 2.2.
12. לשטוף את החרוזים עם 20 מ"ל של 100 mM גליצין-HCl (pH 2.5). הסר את התמיסה במהירות כמתואר בשלב 2.2 כדי למנוע דנטורציה של פוליפפטידים IgG.
13. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 20 מ"ל של 10 mM Tris-HCl (pH 8.8). שאפו את הסופרנאטנט כמתואר בשלב 2.2.
14. הוסף 20 מ"ל של תמיסת טריאתילאמין 0.1M למשך 5-10 דקות תחת סיבוב עדין כדי להשבית את קבוצות האפוקסי הריאקטיביות השיוריות. הסר את supernatant כמתואר בשלב 2.2.
15. שטפו את החרוזים 4x עם 20 מ"ל PBS (pH 7.4) במשך 5 דקות עם סיבוב עדין. הסירו את הסופרנאטנט כמתואר בשלב 2.2 לאחר כל שלב כביסה.
16. שטפו את החרוזים פעמיים עם 20 מ"ל PBS (pH 7.4) עם 0.5% Triton X-100 (w/v) למשך 5 דקות ו-15 דקות כל אחד תחת סיבוב עדין בתנור היברידי. הסר את supernatant כמתואר בשלב 2.2.
17. להשהות את החרוזים בנפח סופי של 16 מ"ל של PBS (pH 7.4) עם 0.02% נתרן אזיד (w/v). יש לאחסן כ-1 מ"ל aliquots ב-4°C עד לשימוש.

3. תרבית תאי שמרים וקציר

1. יש לחסן זני שמרים מוכשרים לבקרה ורקומבינציה מלוחות YPD ב-5 מ"ל של מדיום YPR, ולדגור למשך הלילה ב-30°C וב-200 סל"ד.
2. יש לחסן 2 מ"ל של תרבית זו ב-100 מ"ל של מדיום YPR, ולדגור למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס וב-200 סל"ד.
3. עבור כל זן, יש לפזר 1,800 מ"ל של מדיום YP אוטוקלאבד ו-200 מ"ל של תמיסת רפינוז אוטוקלאבד (20% w/v) לכל אחת משתי צלוחיות ארלנמאייר 5 ליטר (4 ליטר מדיום תרבית בסך הכל לכל זן, מחולקות לשתי צלוחיות).
4. חסן את תאי השמרים הגדלים ב- OD₆₀₀ 0.2 בתווך המתאים שלהם, ודגור כמתואר בשלב 3.1 במשך כ- 6 שעות או עד שהתאים מגיעים ל- OD₆₀₀ הרצוי של 1.0. כדי להבטיח צמיחה תקינה של התאים, ללא כל זיהום, לבדוק את OD במרווחים של 2 שעות.
5. הוסף 200 מ"ל גלקטוז (20% w/v) כדי לגרום לרקומבינציה ספציפית לאתר.
6. הוסף 110 μL (50 ng/mL) של YMFA (במקביל לגלקטוז, שלב 3.5) כדי לעצור את התאים בשלב G1, ולדגור במשך 2 שעות.
   הערה: הוספת YMFA לתאים תלויה בתנאי הניסוי ובשאלה הביולוגית שיש להתייחס אליה. בדיוק, עבור ניסוי זה, התאים נעצרים בשלב G1 כדי לקבל אוכלוסיית תאים הומוגנית עם מקורות שכפול מורשים; בתהליך זה, המכלול הקדם-שכפול נקשר למקורות בשלב G1 לפני תחילת שכפול הדנ"א בשלב S.
7. העבירו את מתלה התא לדלי צנטריפוגות בנפח 1 ליטר ולצנטריפוגות בטמפרטורה של 6,000 × גרם ו-4°C למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדורי התא בנפח כולל של 10-15 מ"ל של dH₂O.
8. אטמו מזרק 25 מ"ל עם תקע Luer, והניחו אותו בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל מלא במים. מעבירים את מתלה התא למכלול המזרק והצנטריפוגה ב-2,397 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
9. הסר את תקע Luer מן המזרק, ו extrude את התאים לתוך חנקן נוזלי כדי ליצור תא "ספגטי".
   הערה: שימוש במדיום תרבית בנפח 4 ליטר מספק משקל רטוב של כדורי התא הסופי של 7-10 גרם.
10. מעבירים את ספגטי התא הקפוא לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל, ומאחסנים בטמפרטורה של 80°C עד לשימוש נוסף.

4. טיהור מוקד כרומטין

הערה: ראו איור 2 לקבלת סקירה סכמטית של השלבים המעורבים בפרוטוקול טיהור כרומטין ספציפי ללוקוס.

1. קררו מטחנת קפה מסחרית על ידי טחינת 30-50 גרם קרח יבש על ידי ניעור נמרץ של מטחנת הקפה פעמיים למשך 30 שניות בכל פעם. לאחר הקירור, השליכו את אבקת הקרח היבש.
2. מערבבים 3 גרם ספגטי תאי שמרים קפואים עם ~30-50 גרם קרח יבש במטחנת הקפה המקוררת מראש.
3. אטמו את הצומת בין הפקק למטחנה עם פרפילם כדי למנוע אובדן של אבקת תאי שמרים במהלך הטחינה.
4. טחנו את תערובת הקרח היבש בתאי שמרים 10x במשך 30 שניות בכל פעם, עם מרווחים של 30 שניות בין כל סיבוב (הערכת זמן כוללת: ~ 10 דקות). כדי למנוע מהקרח היבש ומאבקת התאים להידבק לדפנות מטחנת הקפה, יש להקיש על דפנות מטחנת הקפה ברציפות במהלך הטחינה.
5. מעבירים את אבקת הקרח המייבשת בתאי השמרים המתקבלת לכוס פלסטיק בעזרת מרית נקייה ויבשה.
6. שמור את הכוסות בטמפרטורת החדר כדי לאדות את הקרח היבש.
7. לאחר שהקרח היבש מתאדה, הוסיפו 2.25 מ"ל של מאגר MB עם 1x פרוטאז ומעכבי פוספטאז (750 μL/g של תאי שמרים) לאבקת תאי השמרים.
8. פיפטה תערובת חיץ התא במרץ כדי להבטיח את ההשעיה המלאה של התאים עם החיץ, ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל.
9. קח דגימות עבור ניתוח DNA (0.1%) וחלבון (0.05%) מתרחיף התא שנוצר (תמציות תאים גולמיים [CCE]). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לעיבוד נוסף (המתואר בסעיף 7).
10. העבירו את מתלה התא לצינורות תגובה של 2 מ"ל בעלי קשירה נמוכה, וצנטריפוגות בטמפרטורה של 21,130 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C כדי להפריד את פסולת התא מליזט התא הגולמי.
11. אגרו את הסופרנאטנטים מכל הצינורות לצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל.
12. קח דגימות מהסופרנאטנט (קלט [IN]) עבור DNA (0.1%) וניתוח חלבונים (0.05%). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לעיבוד נוסף (המתואר בסעיף 7).
13. יש לאזן 500 μL של תרחיף חרוזים מגנטי מצומד IgG (עבור כל זן שמרים) על ידי שטיפה 2x עם 500 μL של מאגר MB קר עם 1x protease ומעכבי phosphatase במשך 5 דקות כל אחד ב 4 ° C בסיבוב ב 20 סל"ד. השליכו את הסופרנאטנט מהחרוזים באמצעות מתלה מגנטי לאחר כל שלב כביסה.
14. דגור על חרוזים מגנטיים מצומדים IgG ב 500 μL של מאגר MB קר עם 1x פרוטאז ומעכבי phosphatase במשך 1 שעה ב 4 ° C על סיבוב ב 20 סל"ד. השליכו את הסופרנאטנט מהחרוזים באמצעות מתלה מגנטי.
15. מערבבים את תמיסת החרוזים המגנטיים המאוזנת עם התא ליזט, ודגרים עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך שעתיים ב-4°C.
16. העבירו את תרחיף הליזט המגנטי המלא של תאי החרוזים לצינורות תגובה בעלי קשירה נמוכה.
17. הפרד את החרוזים המגנטיים, הנושאים כעת את טבעות הכרומטין המעניינות, מליזט התא באמצעות מדף מגנטי.
18. העבר את יתרת הזרימה (FT) מכל צינור לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל, וקח דגימות לניתוח DNA (0.1%) וחלבון (0.05%). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לעיבוד נוסף (המתואר בסעיף 7).
19. השהה את החרוזים המגנטיים מכל צינור במאגר MB קר של 300 מיקרוליטר, ואגד את החרוזים לצינור תגובה אחד. יש לשטוף 5x במשך 10 דקות כל אחד עם 750 μL של מאגר MB קר עם 1x protease ומעכבי phosphatase ב 4 ° C בסיבוב ב 20 סל"ד. בצע את השטיפה הסופית עם 750 μL של חיץ MB קר ללא מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
20. להשהות את החרוזים ב 40 μL של מאגר MB קר ללא מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
    הערה: ניתן לכוונן את הנפח הסופי של eluate בהתאם ליישום הצפוי שלו במורד הזרם. ELUTION TEV בדרך כלל עובד ביעילות בטווח של 100-300 μL.

5. אלוציה בתיווך פרוטאז TEV

1. כדי לשחרר קומפלקסים של טבעות כרומטין LexA-CBP מהחרוזים, יש לדגור על החרוזים עם 2 μL של פרוטאז TEV רקומביננטי 6x His-tagged למשך הלילה ב-4°C וב-450 סל"ד בתרמיקוסר.
2. הפרד את החרוזים מהפולט הסופי באמצעות מדף מגנטי. מעבירים את האלואט, המכיל טבעות כרומטין שסועות, לצינור תגובה חדש של 1.5 מ"ל.
3. שמור שוב את הצינורות על מדף מגנטי כדי להפריד את שאריות החרוזים מהפליטה הסופית.
4. השהה מחדש את החרוזים (שחפת) ב-750 מיקרוליטר של חיץ AC קר, וקח דגימות לניתוח DNA (0.1%) וחלבון (0.05%). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לעיבוד נוסף (המתואר בסעיף 7).
5. מהאלואט הסופי (TE), לקחת דגימות לניתוח DNA (0.5%) וחלבון (0.25%). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לעיבוד נוסף (המתואר בסעיף 7).
   הערה: בשל הנפח הנמוך של ה- eluate הסופי, אחוז הדגימות שנאספו לניתוח DNA וחלבונים גדל כדי לקבל ייצוג טוב יותר של תכולת החלבון וה- DNA שלהם במהלך הניתוח.

6. Elution Denaturation

1. שטפו את החרוזים 2x ב-750 מיקרוליטר של חיץ AC קר למשך 20 דקות בכל פעם ב-4°C בסיבוב ב-20 סל"ד.
2. כדי לחלץ את שאר מתחמי LexA-כרומטין מאוגדים, בצע אלוציה דנטורציה על ידי הוספת 500 μL של 0.5M NH₄OH לחרוזים, ודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הפרידו את החרוזים מהמתלה באמצעות מתלה מגנטי, והעבירו את הפולט לצינור תגובה בעל קשירה נמוכה.
4. לדגור על החרוזים שוב כמו בשלב 6.2 כדי לשחזר את מיקומי הכרומטין המרביים בפולט.
5. הפרידו את החרוזים מהמתלה באמצעות מתלה מגנטי, ואגרו את הפולט שנוצר לאותו צינור המכיל את הפולט משלב 6.3.
6. השהה מחדש את החרוזים (DB) ב- 750 μL של dH₂O, וקח דגימות לניתוח DNA (0.1%) וחלבון (0.05%).
7. מהאלואט הסופי (DE), קחו דגימות לניתוח DNA (0.5%) וחלבון (0.25%).

7. ניתוח DNA וחלבונים

1. ניתוח DNA
   1. הכנת דוגמאות
      1. לדגימות הדנ"א, הוסף 100 μL של מאגר IRN, והגדל את הנפח עם dH₂O לנפח סופי של 200 μL.
      2. הוסף 1 ng של K071 ספייק-אין פלסמיד DNA.
      3. הוסף 1 μL של RNAse A (10 מ"ג / מ"ל), ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעות.
      4. הוסף 5 μL של proteinase K (10 מ"ג / מ"ל) ו 10 μL של SDS (20%), ודגור במשך 1 שעה ב 56 ° C.
      5. הוסף 200 μL של פנול/כלורופורם/איזופרופיל אלכוהול (25:24:1), ומערבל היטב 2x במשך 10 שניות בכל פעם.
      6. צנטריפוגה הדגימות ב 21,130 × גרם במשך 7 דקות כדי להפריד את הפאזה האורגנית והמימית.
      7. העבירו את הסופרנאטנט לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל המכילים 1.5 מיקרוליטר גליקוגן (5 מ"ג/מ"ל) ו-2.5x 100% אתנול.
      8. לדגור על הצינורות ב -20 ° C למשך מינימום של 2 שעות ומקסימום של לילה כדי לזרז את ה- DNA.
      9. צנטריפוגה ב-21,130 × גרם, 4°C למשך 45 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
      10. הוסף 150 μL של אתנול 70% מבלי להשעות מחדש את גלולת ה- DNA, וצנטריפוגה שוב ב 21,130 × גרם ב 4 ° C למשך 10 דקות.
      11. יבש את כדורי ה- DNA בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות, והשהה מחדש ב 40 μL של dH₂O.
      12. בצע עיכול אנזים הגבלה כדי ליניאריזציה של ה- DNA שבודד בשלב 7.1.1.11 עם אנדונוקלאז הגבלת HpaI. לקבלת תערובת תגובה של 50 μL, דגרו 40 μL של DNA מבודד + 2 μL של אנזים HpaI + 5 μL של מאגר אנזים הגבלה + 3 μL של dH₂O לילה ב 37 °C.
   2. ניתוח qPCR
      1. לדלל את הדנ"א המעוכל על ידי הגבלה ביחס של 1:5 (10 μL של הדנ"א המעוכל על ידי הגבלה המתקבל משלב 7.1.1.12 ב 40 μL של dH₂O).
      2. השתמש בזוגות פריימרים המיועדים לאזור ARS316, PDC1 ודנ"א פלסמיד ספייק-אין.
      3. הפעל qPCR באמצעות התוכנית המופיעה בטבלה 2.
      4. נתח את תוצאות ה- qPCR על ידי כימות יחסי באמצעות אזור ARS316 ו- DNA פלסמיד ספייק-אין כמטרות ו- PDC1 (או כל גן או אזור גנומי אחר) כמוקד הייחוס.
      5. הערך את אחוז שחזור הלוקוס של ARS316 על פני PDC1 על-ידי נרמול ערכי הכימות היחסי של הפריימר ARS316 ו- PDC1 לפי אחוז נפח השבר שנלקח עבור כל דגימה. לדוגמה, הכפל 0.1% עבור הזרימה בפקטור של 1,000 ו- 0.5% עבור פליטת TEV בפקטור של 200.
      6. נרמל את אחוזי ההתאוששות של ARS316 ו- PDC1 עם ערכי הכימות היחסיים של DNA פלסמיד ספייק.
      7. הערך את ההעשרה של מוקד ARS316 על פני הכרומטין הכולל על ידי הערכת יעד הכימות היחסי המתקבל / ערכי ייחוס באמצעות משוואה (1).
         (1)
   3. ניתוח כתם דרומי
      1. ל-20 μL של דגימת DNA מעוכלת באנזים הגבלה, יש להוסיף 5 μL של צבע העמסת ג'ל.
      2. הפעל את הדגימות בג'ל אגרוז 1% ב 110 V במשך ~ 3 שעות.
      3. מעבירים את הג'ל למגש ומשרים אותו בתמיסת פירוק עם ניעור עדין למשך 20 דקות.
      4. שטפו את הג'ל עם dH₂O, והשרו אותו בתמיסת דנטורציה למשך 15 דקות עם טלטול. השליכו את תמיסת הדנטורציה.
      5. השרו את הג'ל בתמיסת דנטורציה למשך 15 דקות בניעור עדין.
      6. שטפו את הג'ל עם dH₂O, ושטפו אותו 2x במשך 15 דקות בכל פעם עם מאגר ההעברה עם ניעור עדין.
      7. מלא מגש עם 1-1.5 ליטר של מאגר העברה, והנח אותו על פלטפורמה יציבה.
      8. חותכים פיסת נייר Whatman ארוכה, ומניחים אותה על הפלטפורמה כך ששני קצוות הנייר יהיו ספוגים במאגר ההעברה.
      9. חותכים רצועה אחת של קרום ניילון חיובי וארבע רצועות נייר Whatman השוות לגודל הג'ל.
      10. הניחו שתי פיסות נייר Whatman ספוגות במאגר ההעברות על הרציף.
      11. מניחים את הג'ל עם הפנים כלפי מטה על גבי פיסות נייר Whatman.
      12. על גבי הג'ל, מניחים את קרום הניילון החיובי, ואחריו את שתי פיסות נייר Whatman הנותרות ספוגות במאגר העברה. הקפד לשמור על הערימה רטובה באמצעות מאגר ההעברה.
      13. הסר בועות אוויר לכודות על ידי גלגולן באמצעות מוט זכוכית.
      14. הניחו ערימה של מגבות נייר על גבי הערימה שהורכבה, ואחריה חפץ במשקל 0.5 ק"ג (למשל, בקבוק זכוכית).
      15. השאירו את ההרכבה להעברת לילה בטמפרטורת החדר.
      16. לאחר ההעברה, UV-crosslink הממברנה עם תפוקת אנרגיה כוללת של 1,200 J / cm².
      17. לזיהוי מוקד ARS316, בצע הכלאה של כתם דרומי באמצעות בדיקות רדיואקטיביות המסונתזות באמצעות מערכת תיוג ה- DNA המוזכרת.
          הערה: בצע את כל השלבים הבאים על קרח עד לציון אחר.
      18. בצינור תגובה בעל קשירה נמוכה, יש לדלל 25-40 ננוגרם של מקטע PCR (בדיקה) ב-19 מיקרוליטר של dH₂O, ולדגור ב-95°C למשך 5 דקות. מצננים מיד על קרח.
      19. הוסף 1 μL כל אחד של 500 μM dCTP, 500 μM dGTP ו- 500 μM dTTP לצינור.
      20. הוסף 20 μL של המאגר המכיל hexamers נוקלאוטידים אקראיים שסופקו עם הערכה.
      21. הוסף 5 μL של הנוקלאוטיד המסומן רדיואקטיבית [^α-32P] dATP לצינור. בצע את כל השלבים הכוללים חומר המסומן רדיואקטיבית תחת סביבת הגנה מאושרת רדיואקטיביות.
      22. הוסף 1 μL של מקטע Klenow, ודגר ב 37 ° C על thermomixer במשך 15 דקות עבור סינתזת DNA חד גדילי.
      23. הוסף 5 μL של מאגר עצירה כדי לעצור את התגובה.
      24. צנטריפוגה עמודת אי הכללת גודל למשך 2 דקות ב- 1,500 × גרם כדי להסיר את מאגר האחסון. השליכו את הזרימה והניחו את העמוד בצינור טרי.
      25. העבירו את תערובת הגשושית דרך העמוד כדי להסיר נוקלאוטידים רדיואקטיביים לא משולבים. צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 1,500 × גרם כדי לאסוף את הגשושית.
      26. הוסף 150 μL של DNA זרע סלמון (1:100) כדי לחסום את הקישור הלא ספציפי של הבדיקה לממברנה.
      27. דגרו על תערובת הגשושית בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות כדי לנטרל את הדנ"א הדו-גדילי.
      28. הקפיאו על קרח למשך מספר שניות, וצנטריפוגה למשך מספר שניות בטמפרטורה של 500 × גרם כדי להוריד את טיפות המים המעובות על המכסה.
      29. לשטוף בקצרה את קרום הכתם הדרומי עם חיץ הכלאה במשך 5-10 דקות עם סיבוב.
      30. טרום הכלאה של הממברנה עם חיץ ההכלאה למשך שעה אחת ב 55 ° C עם סיבוב. השליכו את מאגר ההכלאה.
      31. הוסף 15 מ"ל של חיץ הכלאה טרי (מחומם מראש ב 55 ° C) לממברנה יחד עם הבדיקה המוכנה. לדגור את הממברנה לילה ב 55 °C עם סיבוב.
      32. בצעו שטיפות לאחר הכלאה פעמיים במשך 15 דקות כל אחת עם 0.3x SSC, 0.1% SDS ב-55°C עם סיבוב.
      33. בצעו שטיפות לאחר הכלאה פעמיים במשך 15 דקות כל אחת עם 0.1x SSC, 0.1% SDS ב-55°C עם סיבוב.
      34. בצעו שטיפות לאחר הכלאה פעמיים במשך 15 דקות כל אחת עם 0.1x SSC, 1.5% SDS ב-55°C עם סיבוב.
      35. הסר את הממברנה מצינור ההכלאה, וחשף את הממברנה למסך זרחן למשך עד 3 ימים כדי לקבל את הטביעות הרדיואקטיביות על הסרט.
      36. קבל תמונות של הסרט באמצעות מערכת סריקת לייזר זרחן.
2. ניתוח חלבונים
   1. הכנת דוגמאות
      1. התאם את כל דגימות החלבון לנפחים הסופיים שלהן (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL ו- 20 μL עבור תמצית התאים הגולמיים, הקלט, הזרימה, החרוזים והדגימות הפולטות, בהתאמה) על ידי הוספת 1 μL של β-מרקפטואתנול, מאגר דגימות PAGE LDS (1x) ו- dH₂O.
      2. נטרל את הדגימות ב 95 ° C למשך 5 דקות.
   2. ניתוח כתמים מערביים
      הערה: בצע SDS-PAGE וניקוי מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים^15,16.
      1. טען 15 μL מכל דגימה לכל באר של ג'ל SDS-PAGE 1.5 מ"מ.
      2. ביצוע אימונוסטיין של הכתם באמצעות נוגדני PAP (1:2,000) ו-LexA (1:1,000) עם דגירה לילית ב-4°C. יש לדלל בתמיסת חלב יבש/PBST 5%.
         הערה: לאחר ניתוח PAP, ניתן להסיר את הכתם באמצעות פרוטוקול הפשטה קלה¹⁷ לפני הכתמה חיסונית עם נוגדן LexA השני.

תוצאות

הטיהור של תחום הכרומטין ARS316 ~ 1.4 kb תווך על ידי חלבון מתאם LexA-TAP המתבטא באופן מכונן . כדי לשמש כבקרה שלילית, ביצענו טיהור באמצעות זן איזוגני המבטא LexA-TAP אך אינו מכיל אתרים משולבים של RS ו-LexA. איור 3 מדגים את תוצאות ניתוח הדנ"א מניסוי טיהור סטנדרטי שבוצע הן על קבוצת הבקרה והן על זן ב?...

Discussion

זיהוי הגורמים ונוף הכרומטין של אזור גנומי מטרה ספציפי ממשיך להוות אתגר מרכזי במחקר הכרומטין¹⁸. פרוטוקול זה מתאר מערכת יעילה לכריתה וטיהור ספציפית של תחומי כרומטין נפרדים מכרומוזומי שמרים. למיטב ידיעתנו, הטוהר והתשואה של טיהור חד-שלבי זה מתגברים על רבות מהמגבלות של שיטות טיהו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid			Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA			Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone	Carl Roth	5025.1	Section 2 Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac)	Sigma Aldrich	A7262	Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25%	Merck Millipore	533003	Section 6 Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate	Santa Cruz	Sc-29085	Section 2 Storage: Store at room temperature
Bacto agar	BD (VWR)	90000-760	Section 3 Storage: Store at room temperature
Bacto peptone	BD (VWR)	211820	Section 3 Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	07604	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit	ThermoFisher	34580	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate	Merck	1.06579.1000	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher	15508013	Section 4 Storage: Store at 4 °C
Ethanol	Merck	100983	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock)	Sigma Aldrich	G0625-1KG  /  5KG	Section 3 Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x)	BioLabs	B7024A	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Glusose	Sigma-Aldrich	G8270	Section Storage: Store at room temperature
Glycine	Carl Roth	.0079.4	Section 2 Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL)	Invitrogen	AM9510	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	PanReac AppliChem	182109.1211	Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc)	Bernd Kraft	15274.2600/C035	Section 4 Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266	Section 6 Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)	Invitrogen	2399549	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v)	Invitrogen	15593-031	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541	Section 4 Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)	Hartmann Analytic	SRP-203	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system	ThermoFisher	18428-011	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock)	SERVA	34140.03	Section 3 Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl)	Merck	K53710504142	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	Sigma-Aldrich	71402	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) )	Alfa Aesar	A11183	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium azide	Santa Cruz Biotechnology	sc-208393	Section 2 Storage: Store at -20 °C
Triethylamine	Sigma Aldrich	90340	Section 2 Storage: Store at room temperature
Tris base	Chem Cruz	SC-3715B	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	Section 4 Storage: Store at room temperature
Yeast extract	BD (VWR)	212720	Section 3 Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )	Biomol	Y2016.5	Section 3 Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE	Sigma Aldrich	Y1376	Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)	NEB	R0105S	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78446	Section 4 Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL)	SERVA	33756	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)	ThermoFisher	EN0531	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL)	NEB	P8112S	Section 5 Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads	Bioclone Inc.	FC-102	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Dry ice			Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Section 4
Microspin G-25 Columns	Cytiva	27-5325-01	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Parafilm	Merck	P7793	Section 4
Positive nylon membrane	Biozol	11MEMP0001	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)	Invitrogen	NP0336BOX	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting	Henke Sass Wolf	4200-000V0	Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)	Cytiva	3030-917	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody	Merck Millipore	06-719	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate	Invitrogen	G21234	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins	Sigma Aldrich	P1291-500UL	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies	Sigma	I5006-100MG	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT			Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			Section 7.1
Equipment
Coffee grinder	Gastroback	42601	Section 4
Dewar flask	NAL GENE	4150-2000	Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack	Invitrogen	12321D	Section 4, 5 and 6
Hybridization oven	Hybaid Mini10	Ri418	Section 2
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	Section 4 and 7.1
UV-crosslinker	Analytikjena	95-0174-02	Section 7.1