Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae

Резюме

В этом протоколе представлен локусоспецифический метод выделения хроматина, основанный на сайт-специфической рекомбинации, для очистки однокопийного гена, представляющего интерес в его нативном контексте хроматина, от почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Основной организационной единицей эукариотического хроматина является частица ядра нуклеосомы (NCP), которая состоит из ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистона. Хроматин определяется как сущность NCP и многих других белковых комплексов, включая транскрипционные факторы, ремоделирование хроматина и модифицирующие ферменты. До сих пор неясно, как эти белок-ДНК-взаимодействия организуются на уровне специфических геномных локусов на разных стадиях клеточного цикла. В основном это связано с текущими техническими ограничениями, которые затрудняют получение точных измерений таких динамических взаимодействий. В этой статье мы опишем усовершенствованный метод, сочетающий сайт-специфичную рекомбинацию с эффективным одноступенчатым протоколом аффинной очистки для выделения интересующего нас однокопийного гена в его нативном хроматиновом состоянии. Этот метод позволяет надежно обогащать целевой локус с помощью геномного хроматина, что делает этот метод эффективной стратегией для идентификации и количественной оценки белковых взаимодействий непредвзятым и систематическим образом, например, с помощью масс-спектрометрии. В дополнение к такому анализу состава, нативный хроматин, очищенный этим методом, вероятно, отражает ситуацию in vivo в отношении позиционирования нуклеосом и модификаций гистонов и, следовательно, поддается дальнейшему структурному и биохимическому анализу хроматина, полученного практически из любого геномного локуса у дрожжей.

Введение

Динамическая организация эукариотических геномов в хроматин уплотняет ДНК, чтобы она помещалась в пределах ядра, обеспечивая при этом достаточную динамику для экспрессии генов и доступность регуляторных факторов. Отчасти эта универсальность опосредована нуклеосомой, основной единицей хроматина, которая состоит из основной частицы со 147.н. ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистонов¹. Нуклеосома представляет собой очень динамичную структуру по отношению к своему составу, с многочисленными вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями (ПТМ) на N- и C-концевых хвостах гистонов. Кроме того, эукариотический хроматин взаимодействует ....

протокол

Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и инструментами, используемыми в этом протоколе. В таблице 1 приведен список используемых решений, буферов и носителей.

1. Построение штамма рекомбинантных дрожжей

1. Чтобы сконструировать рекомбинационно-компетентный штамм дрожжей, трансформируют SbfI-переваренную плазмиду K238 в штамм дрожжей с интегрированными LexA-связывающими сайтами и сайтами рекомбинации RS в интересующем локусе^13,14.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформированный фрагмен....

Результаты

Очистка домена хроматина ARS316 ~1,4 kb была опосредована конститутивно экспрессируемым белком-адаптером LexA-TAP. В качестве отрицательного контроля мы проводили очистки с использованием изогенного штамма, экспрессирующего LexA-TAP, но не содержащего интегрированных RS и LexA-связывающих сайтов.

Обсуждение

Идентификация факторов и хроматинового ландшафта конкретной целевой области генома по-прежнему представляет собой серьезную проблему в исследованиях хроматина¹⁸. Этот протокол описывает эффективную систему специфического удаления и очистки различных доменов хроматина.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid			Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA			Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone	Carl Roth	5025.1	Section 2 Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac)	Sigma Aldrich	A7262	Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25%	Merck Millipore	533003	Section 6 Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate	Santa Cruz	Sc-29085	Section 2 Storage: Store at room temperature
Bacto agar	BD (VWR)	90000-760	Section 3 Storage: Store at room temperature
Bacto peptone	BD (VWR)	211820	Section 3 Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	07604	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit	ThermoFisher	34580	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate	Merck	1.06579.1000	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher	15508013	Section 4 Storage: Store at 4 °C
Ethanol	Merck	100983	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock)	Sigma Aldrich	G0625-1KG  /  5KG	Section 3 Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x)	BioLabs	B7024A	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Glusose	Sigma-Aldrich	G8270	Section Storage: Store at room temperature
Glycine	Carl Roth	.0079.4	Section 2 Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL)	Invitrogen	AM9510	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	PanReac AppliChem	182109.1211	Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc)	Bernd Kraft	15274.2600/C035	Section 4 Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266	Section 6 Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)	Invitrogen	2399549	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v)	Invitrogen	15593-031	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541	Section 4 Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)	Hartmann Analytic	SRP-203	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system	ThermoFisher	18428-011	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock)	SERVA	34140.03	Section 3 Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl)	Merck	K53710504142	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	Sigma-Aldrich	71402	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) )	Alfa Aesar	A11183	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium azide	Santa Cruz Biotechnology	sc-208393	Section 2 Storage: Store at -20 °C
Triethylamine	Sigma Aldrich	90340	Section 2 Storage: Store at room temperature
Tris base	Chem Cruz	SC-3715B	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	Section 4 Storage: Store at room temperature
Yeast extract	BD (VWR)	212720	Section 3 Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )	Biomol	Y2016.5	Section 3 Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE	Sigma Aldrich	Y1376	Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)	NEB	R0105S	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78446	Section 4 Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL)	SERVA	33756	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)	ThermoFisher	EN0531	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL)	NEB	P8112S	Section 5 Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads	Bioclone Inc.	FC-102	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Dry ice			Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Section 4
Microspin G-25 Columns	Cytiva	27-5325-01	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Parafilm	Merck	P7793	Section 4
Positive nylon membrane	Biozol	11MEMP0001	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)	Invitrogen	NP0336BOX	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting	Henke Sass Wolf	4200-000V0	Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)	Cytiva	3030-917	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody	Merck Millipore	06-719	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate	Invitrogen	G21234	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins	Sigma Aldrich	P1291-500UL	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies	Sigma	I5006-100MG	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT			Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			Section 7.1
Equipment
Coffee grinder	Gastroback	42601	Section 4
Dewar flask	NAL GENE	4150-2000	Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack	Invitrogen	12321D	Section 4, 5 and 6
Hybridization oven	Hybaid Mini10	Ri418	Section 2
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	Section 4 and 7.1
UV-crosslinker	Analytikjena	95-0174-02	Section 7.1