Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae

Резюме

В этом протоколе представлен локусоспецифический метод выделения хроматина, основанный на сайт-специфической рекомбинации, для очистки однокопийного гена, представляющего интерес в его нативном контексте хроматина, от почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Основной организационной единицей эукариотического хроматина является частица ядра нуклеосомы (NCP), которая состоит из ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистона. Хроматин определяется как сущность NCP и многих других белковых комплексов, включая транскрипционные факторы, ремоделирование хроматина и модифицирующие ферменты. До сих пор неясно, как эти белок-ДНК-взаимодействия организуются на уровне специфических геномных локусов на разных стадиях клеточного цикла. В основном это связано с текущими техническими ограничениями, которые затрудняют получение точных измерений таких динамических взаимодействий. В этой статье мы опишем усовершенствованный метод, сочетающий сайт-специфичную рекомбинацию с эффективным одноступенчатым протоколом аффинной очистки для выделения интересующего нас однокопийного гена в его нативном хроматиновом состоянии. Этот метод позволяет надежно обогащать целевой локус с помощью геномного хроматина, что делает этот метод эффективной стратегией для идентификации и количественной оценки белковых взаимодействий непредвзятым и систематическим образом, например, с помощью масс-спектрометрии. В дополнение к такому анализу состава, нативный хроматин, очищенный этим методом, вероятно, отражает ситуацию in vivo в отношении позиционирования нуклеосом и модификаций гистонов и, следовательно, поддается дальнейшему структурному и биохимическому анализу хроматина, полученного практически из любого геномного локуса у дрожжей.

Введение

Динамическая организация эукариотических геномов в хроматин уплотняет ДНК, чтобы она помещалась в пределах ядра, обеспечивая при этом достаточную динамику для экспрессии генов и доступность регуляторных факторов. Отчасти эта универсальность опосредована нуклеосомой, основной единицей хроматина, которая состоит из основной частицы со 147.н. ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистонов¹. Нуклеосома представляет собой очень динамичную структуру по отношению к своему составу, с многочисленными вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями (ПТМ) на N- и C-концевых хвостах гистонов. Кроме того, эукариотический хроматин взаимодействует с множеством других важных компонентов, таких как транскрипционные факторы, механизмы обработки ДНК и РНК, архитектурные белки, ферменты, участвующие в ремоделировании и модификации хроматина, и молекулы РНК, связанные с хроматином. Эти важнейшие механизмы, участвующие в транскрипции, репликации и репарации, требуют доступа к хроматину, который служит естественным субстратом для этих процессов. Следовательно, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих трансакций ДНК, требует точного определения коллективных изменений в структуре хроматина в конкретных областях генома, где эти механизмы сходятся и способствуют биологическим реакциям.

Несмотря на идентификацию многочисленных факторов хроматина с помощью генетики и исследований белок-белкового взаимодействия, проведение прямого, непредвзятого и всестороннего анализа взаимодействий хроматина на конкретных участках генома остается существенным препятствием ^2,3. Первоначально для масс-спектрометрической идентификации ассоциированных белков 4,5,6,7 можно было выделить только очень распространенные участки генома (т.е. повторяющиеся локусы) или многокопийные плазмиды. Ряд новых подходов, основанных на прямой гибридизации зондов захвата с хроматинизированной ДНК, бесконтактном биотинилировании с использованием системы CRISPR-dCas9 или связывании последовательно-специфических белков-адаптеров с интересующим локусом, начал распутывать протеом однокопийных локусов из геномов дрожжей и млекопитающих ^8,9,10. Однако все эти методы требуют сшивания формальдегида для стабилизации белок-ДНК взаимодействий и ультразвуковой обработки для солюбилизации хроматина для последующей очистки. В совокупности обе манипуляции исключают возможность последующих структурно-функциональных исследований очищенного хроматина.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы ранее разработали методологию, которая использует сайт-специфическую рекомбинацию для извлечения целевых хромосомных доменов из дрожжей^11,12. По сути, интересующая область генома окружена сайт-специфической R-рекомбиназой из Zygosaccharomyces rouxi и одновременно включает группу из трех сайтов связывания ДНК для прокариотического транскрипционного репрессора белка LexA (LexA) в пределах одной и той же области. Дрожжевые клетки содержат экспрессионную кассету для одновременной экспрессии R-рекомбиназы и белка LexA, соединенного с меткой тандемной аффинной очистки (TAP). После индукции R-рекомбиназы фермент эффективно удаляет целевой участок из хромосомы в виде кольцевого домена хроматина. Этот домен может быть очищен с помощью белка-адаптера LexA-TAP, который связывается с сайтами связывания ДНК LexA, а также с аффинной опорой. Этот метод недавно был использован для выделения отдельных доменов хроматина, содержащих выбранные репликационные источники^13-й хромосомы дрожжей.

Одним из основных преимуществ этого подхода ex vivo является то, что он позволяет проводить функциональный анализ изолированного материала. Например, репликационные исходные домены, очищенные с помощью этого метода, могут быть подвергнуты анализу репликации in vitro для оценки эффективности возбуждения исходного сырья в пробирке из нативных хроматиновых матриц in vivo . В конечном счете, биохимическая и функциональная характеристика выделенного материала может позволить восстановить ядерные процессы с использованием очищенных белков вместе с нативным хроматиновым шаблоном. Таким образом, эта методология открывает захватывающие возможности в исследовании хроматина, поскольку можно будет проследить коллективные изменения состава и структуры хроматина в определенной области генома, претерпевающей определенную хромосомную трансакцию.

протокол

Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и инструментами, используемыми в этом протоколе. В таблице 1 приведен список используемых решений, буферов и носителей.

1. Построение штамма рекомбинантных дрожжей

1. Чтобы сконструировать рекомбинационно-компетентный штамм дрожжей, трансформируют SbfI-переваренную плазмиду K238 в штамм дрожжей с интегрированными LexA-связывающими сайтами и сайтами рекомбинации RS в интересующем локусе^13,14.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформированный фрагмент рестрикции SbfI содержит необходимую экспрессионную кассету для конститутивной экспрессии белка слияния LexA-TAP и R-рекомбиназы вместе с гомологичными последовательностями хромосомы I дрожжей для геномной интеграции экспрессионной кассеты путем гомологичной рекомбинации (рис. 1).
2. Для создания контрольного штамма берут изогенный штамм дрожжей, в котором отсутствуют интегрированные RS- и LexA-связывающие сайты, и трансформируют его с SbfI-расщепленной плазмидой K238 в тех же условиях, что и для рекомбинационно-компетентного штамма.
3. Выберите компетентные дрожжевые клетки на основе маркера отбора LEU2 на агаровых пластинах SCD-LEU¹⁴.

2. Связывание антител IgG с эпоксидно-активированными магнитными шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Соедините антитела IgG с магнитными шариками, активированными эпоксидной смолой, в соответствии со следующим опубликованным протоколом¹¹.

1. Суспендировать 300 мг гранул, активированных эпоксидной смолой, в 10 мл 50% ацетона (300 мг соответствует ~5,1 ×^{10 10} шариков) в конической пробирке объемом 50 мл. Энергично встряхните на вихревом миксере.
2. Центрифугируют пробирку с гранулами при 820 × г и 4 °C в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость.
3. Промойте шарики 3 раза 20 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4). Удаляйте надосадочную жидкость после каждого этапа промывки центрифугированием, как описано в шаге 2.2.
4. Суспендируйте шарики в 16 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4) и осторожно вращайте в гибридизационной печи в течение 5 минут при комнатной температуре.
5. Растворите IgG кролика (100 мг) в 7 мл dH₂O (конечная концентрация: 14 мг/мл).
6. Центрифугируют суспензию IgG при 13 000 × г и 4 °C в течение 10 мин для осветления суспензии.
7. Переложите 3,5 мл надосадочной жидкости (что соответствует 50 мг кроличьих IgG) в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
8. Раствор IgG разбавляют 9,85 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера (рН 7,4) с последующим добавлением по каплям 6,65 мл 3 М сульфата аммония в 0,1 М фосфата натрия (рН 7,4) при осторожном перемешивании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте быстрого добавления сульфата аммония в раствор, так как высокая локальная концентрация соли вызовет осаждение IgG кролика.
9. Центрифугируют раствор IgG при 820 × g и 4 °C в течение 3 мин и добавляют полученную надосадочную жидкость к суспензии магнитного шарика.
10. Инкубируйте пробирку в течение ночи или не менее 18 ч при 30 °C при осторожном вращении в гибридизационной печи.
11. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
12. Промойте шарики 20 мл 100 мМ глицина-HCl (рН 2,5). Быстро удалите раствор, как описано в шаге 2.2, чтобы избежать денатурации полипептидов IgG.
13. Промойте бусины один раз 20 мл 10 мМ Tris-HCl (pH 8,8). Аспирируйте надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
14. Добавьте 20 мл 0,1М раствора триэтиламина в течение 5-10 мин при осторожном вращении для инактивации остаточных реакционноспособных эпоксидных групп. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
15. Промойте бусины 4 раза 20 мл PBS (pH 7,4) в течение 5 минут с легким вращением. Удаляйте надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2, после каждого этапа стирки.
16. Промойте бусины 2 раза 20 мл PBS (pH 7,4) с 0,5% Triton X-100 (w/v) в течение 5 минут и 15 минут каждый при осторожном вращении в гибридизационной печи. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
17. Суспендировать шарики в конечном объеме 16 мл PBS (pH 7,4) с 0,02% азида натрия (w/v). Хранить в виде аликвот по 1 мл при температуре 4 °C до использования.

3. Культивирование и сбор дрожжевых клеток

1. Высейте контрольные и рекомбинационные компетентные штаммы дрожжей с планшетов YPD в 5 мл среды YPR и инкубируйте в течение ночи при 30 °C и 200 об/мин.
2. Высейте 2 мл этой культуры в 100 мл среды YPR и инкубируйте в течение ночи при 30 °C и 200 об/мин.
3. Для каждого штамма дозируют 1 800 мл автоклавной среды YP и 200 мл автоклавного раствора рафинозы (20% по массе) в каждую из двух 5-литровых колб Эрленмейера (всего 4 л питательной среды для каждого штамма, разделенных на две колбы).
4. Посев растущих дрожжевых клеток при наружном диаметре₆₀₀ 0,2 в соответствующую среду и инкубируют, как описано в шаге 3.1, в течение примерно 6 ч или до тех пор, пока клетки не достигнут желаемого наружного диаметра₆₀₀ 1,0. Чтобы обеспечить нормальный рост клеток, свободных от каких-либо загрязнений, проверяйте наружный диаметр с интервалом в 2 часа.
5. Добавьте 200 мл галактозы (20% по массе), чтобы индуцировать сайт-специфическую рекомбинацию.
6. Добавьте 110 мкл (50 нг/мл) YMCA (одновременно с галактозой, шаг 3,5), чтобы остановить клетки в фазе G1, и инкубируйте в течение 2 ч.
   Примечание: Добавление YMFA к клеткам зависит от условий эксперимента и биологического вопроса, который необходимо решить. В частности, для этого эксперимента клетки задерживаются в фазе G1 для получения однородной клеточной популяции с лицензированным репликационным происхождением; в этом процессе пререпликативный комплекс связывается с источниками в фазе G1 до начала репликации ДНК в фазе S.
7. Переложите клеточную суспензию в центрифужные ведра объемом 1 л и центрифугируйте при температуре 6 000 × г и температуре 4 °C в течение 10 мин. Надосадочную жидкость выбросить, и повторно суспендировать клеточные гранулы в общем объеме 10-15 мл dH₂O.
8. Запечатайте шприц объемом 25 мл пробкой Луэра и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл, наполненную водой. Переложите клеточную суспензию в шприцевой узел и центрифугируйте при 2,397 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.
9. Выньте пробку Люэра из шприца и выдавите клетки в жидкий азот, чтобы сформировать клеточные «спагетти».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 4 л питательной среды обеспечивает влажную массу конечных клеточных гранул 7-10 г.
10. Переложите спагетти с замороженными клетками в коническую пробирку объемом 50 мл и храните при температуре −80 °C до дальнейшего использования.

4. Очистка локуса хроматина

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 приведен схематический обзор этапов, выполняемых в этом протоколе локус-специфической очистки хроматина.

1. Охладите коммерческую кофемолку, измельчив 30-50 г сухого льда, энергично встряхивая кофемолку 2 раза в течение 30 секунд каждый раз. После охлаждения выбросьте порошок сухого льда.
2. Смешайте 3 г замороженных спагетти с дрожжами с ~30-50 г сухого льда в предварительно охлажденной кофемолке.
3. Загерметизируйте стык между крышкой и измельчителем парапленкой, чтобы предотвратить потерю порошка дрожжевых клеток во время измельчения.
4. Измельчите смесь дрожжевых клеток и сухого льда 10 раз в течение 30 секунд каждый раз, с интервалом 30 секунд между каждым раундом (общее время: ~10 минут). Чтобы сухой лед и клеточный порошок не прилипали к стенкам кофемолки, постоянно постукивайте по стенкам кофемолки во время измельчения.
5. Переложите полученную дрожжевую клетку-сухой порошок льда в пластиковый стакан с помощью чистой и сухой лопатки.
6. Держите стаканы при комнатной температуре, чтобы испарился сухой лед.
7. Как только сухой лед испарится, добавьте 2,25 мл буфера MB с 1 ингибиторами протеазы и фосфатазы (750 мкл/г дрожжевых клеток) в порошок дрожжевых клеток.
8. Энергично пипетируйте клеточно-буферную смесь, чтобы обеспечить полную суспензию клеток с буфером, и перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл.
9. Возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%) из полученной клеточной суспензии (экстракты сырых клеток [CCE]). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
10. Переложите клеточную суспензию в реакционные пробирки объемом 2 мл с низким связыванием и центрифугируйте при 21 130 × г в течение 30 мин при 4 °C, чтобы отделить клеточный мусор от сырого клеточного лизата.
11. Смешайте надосадочную жидкость из всех пробирок в одну коническую пробирку объемом 15 мл.
12. Возьмите образцы из надосадочной жидкости (вход [IN]) для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
13. Уравновешивают 500 мкл суспензии магнитных шариков, связанных с IgG (для каждого штамма дрожжей), промывая 2 раза 500 мкл холодного буфера MB с 1 ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 5 мин каждый при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Удаляйте надосадочную жидкость из бусин с помощью магнитной решетки после каждого этапа стирки.
14. Инкубируют магнитные шарики, связанные с IgG, в 500 мкл холодного буфера MB с 1x ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 1 ч при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Выбросьте надосадочную жидкость из бусин с помощью магнитной стойки.
15. Смешайте уравновешенную суспензию магнитных шариков с клеточным лизатом и инкубируйте при вращении при 20 об/мин в течение 2 ч при 4 °C.
16. Перенесите полную суспензию лизата магнитных шариков в реакционные пробирки с низким связыванием.
17. Отделите магнитные шарики, несущие интересующие кольца хроматина, от клеточного лизата с помощью магнитной стойки.
18. Перелейте оставшуюся проточную часть (FT) из каждой пробирки в свежую коническую пробирку объемом 15 мл и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
19. Суспендируйте магнитные шарики из каждой пробирки в 300 мкл холодного буфера MB и объедините шарики в одну реакционную пробирку. Промыть 5 раз по 10 мин каждый с 750 мкл холодного буфера MB с 1 ингибитором протеазы и фосфатазы при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Окончательную промывку проводят 750 мкл холодного буфера MB без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
20. Суспендировать шарики в 40 мкл холодного буфера МБ без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем элюата может быть скорректирован в соответствии с его предполагаемым последующим применением. Элюирование ТЭВ обычно эффективно работает в диапазоне 100-300 мкл.

5. Протеаза-опосредованное элюирование ТЭВ

1. Чтобы высвободить кольцевые комплексы хроматина LexA-CBP из гранул, инкубируйте гранулы с 2 мкл 6-кратной рекомбинантной протеазы ТЭВ, помеченной His, в течение ночи при 4 °C и 450 об/мин в термомиксере.
2. Отделите бисер от готового элюата с помощью магнитной стойки. Переложите элюат, содержащий расщепленные кольца хроматина, в новую реакционную пробирку объемом 1,5 мл.
3. Снова поместите пробирки на магнитную решетку, чтобы отделить остатки гранул от конечного элюата.
4. Ресуспендант гранул (TB) в 750 мкл холодного буфера переменного тока и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
5. Из окончательного элюата (TE) берут образцы для анализа ДНК (0,5%) и белка (0,25%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за малого объема конечного элюата процент образцов, собранных для анализа ДНК и белка, увеличивается, чтобы получить лучшее представление о содержании белка и ДНК в них во время анализа.

6. Элюирование денатурации

1. Промыть шарики 2 раза в 750 мкл холодного буфера переменного тока в течение 20 минут каждый раз при 4 °C при вращении при 20 об/мин.
2. Для извлечения оставшихся связанных комплексов LexA-хроматина проводят денатурационное элюирование, добавляя к гранулам 500 мкл 0,5М NH₄OH, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Отделите гранулы от суспензии с помощью магнитной стойки и перенесите элюат в реакционную пробирку с низким связыванием.
4. Снова инкубируйте шарики, как показано на шаге 6.2, чтобы восстановить максимальное количество локусов хроматина в элюате.
5. Отделите шарики от суспензии с помощью магнитной стойки и соберите полученный элюат в ту же пробирку, содержащую элюат из шага 6.3.
6. Ресуспендируйте шарики (DB) в 750 мкл dH₂O и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%).
7. Из конечного элюата (ДЭ) берут образцы для анализа ДНК (0,5%) и белка (0,25%).

7. Анализ ДНК и белков

1. Анализ ДНК
   1. Пробоподготовка
      1. К образцам ДНК добавляют 100 мкл буфера IRN и увеличивают объем dH_2Oдо конечного объема 200 мкл.
      2. Добавьте 1 нг спайковой плазмидной ДНК K071.
      3. Добавьте 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
      4. Добавьте 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и 10 мкл SDS (20%) и инкубируйте в течение 1 ч при 56 °C.
      5. Добавьте 200 мкл фенола/хлороформа/изопропилового спирта (25:24:1) и тщательно перемешайте 2 раза в течение 10 секунд каждый раз.
      6. Центрифугируют образцы при 21 130 × г в течение 7 мин для разделения органической и водной фаз.
      7. Перелейте надосадочную жидкость в новые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 1,5 мкл гликогена (5 мг/мл) и 2,5 100% этанола.
      8. Инкубируйте пробирки при температуре −20 °C не менее 2 ч и не более ночи до осаждения ДНК.
      9. Центрифуга при 21 130 × г, 4 °C в течение 45 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
      10. Добавьте 150 мкл 70% этанола без ресуспендирования гранулы ДНК и снова центрифугируйте при 21 130 × г при 4 °C в течение 10 мин.
      11. Высушите гранулы ДНК при комнатной температуре в течение 10-15 мин и ресуспендируйте в 40 мкл dH₂O.
      12. Выполните расщепление ферментом рестрикции для линеаризации ДНК, выделенной на этапе 7.1.1.11, эндонуклеазой рестрикции HpaI. Для реакционной смеси объемом 50 мкл инкубируют 40 мкл изолированной ДНК + 2 мкл фермента HpaI + 5 мкл буфера фермента рестрикции + 3 мкл dH₂O в течение ночи при 37 °C.
   2. кПЦР-анализ
      1. Разбавляют рестрикционно-расщепленную ДНК в соотношении 1:5 (10 мкл рестрикционно-расщепленной ДНК, полученной на стадии 7.1.1.12, в 40 мкл dH₂O).
      2. Используйте пары праймеров, предназначенные для области ARS316, PDC1 и спайковой плазмидной ДНК.
      3. Запустите qPCR с помощью программы, приведенной в таблице 2.
      4. Анализируйте результаты кПЦР путем относительного количественного определения, используя область ARS316 и спайковую плазмидную ДНК в качестве мишеней и PDC1 (или любой другой ген или область генома) в качестве референсного локуса.
      5. Оцените процент извлечения локуса ARS316 по сравнению с PDC1 путем нормализации относительных количественных значений праймеров ARS316 и PDC1 на процент объема фракции, взятой для каждого образца. Например, умножьте 0,1% для проточного значения на коэффициент 1 000 и 0,5% для элюирования ТЭВ на коэффициент 200.
      6. Нормализуйте проценты восстановления ARS316 и PDC1 с помощью относительных количественных значений спайковой плазмидной ДНК.
      7. Оцените обогащение локуса ARS316 по общему хроматину, оценив полученные относительные количественные целевые/референсные значения с помощью уравнения (1).
         (1)
   3. Анализ Саузерн блоттинг
      1. К 20 мкл образца ДНК, расщепленного ферментом рестрикции, добавляют 5 мкл красителя с гелевой загрузкой.
      2. Прогонят образцы в 1% агарозном геле при 110 В в течение ~3 ч.
      3. Переложите гель на лоток и замочите его в растворе для депурирования при легком встряхивании на 20 минут.
      4. Смойте гель dH₂O и замочите его в денатурационном растворе на 15 минут при встряхивании. Раствор для денатурации выбросьте.
      5. Замочите гель в денатурационном растворе на 15 мин при легком встряхивании.
      6. Смойте гель dH₂O и промывайте его 2 раза в течение 15 минут каждый раз с помощью буфера для переноса с легким встряхиванием.
      7. Наполните лоток 1-1,5 л буфера для перекачки и поставьте его на устойчивую платформу.
      8. Отрежьте длинный кусок ватмана и положите его на платформу таким образом, чтобы два конца бумаги пропитались буфером для переноса.
      9. Отрежьте одну полоску положительной нейлоновой мембраны и четыре полоски ватмана, равные размеру геля.
      10. Положите на платформу два листа ватмана, смоченных в буфере для переноса.
      11. Положите гель лицевой стороной вниз на кусочки ватмана.
      12. Поверх геля положите положительную нейлоновую мембрану, а затем оставшиеся два кусочка ватмана, смоченные в трансферном буфере. Следите за тем, чтобы стек оставался влажным с буфером передачи.
      13. Удалите все застрявшие пузырьки воздуха, скрутив их стеклянной палочкой.
      14. Положите стопку бумажных полотенец поверх собранной стопки, а затем предмет весом 0,5 кг (например, стеклянную бутылку).
      15. Оставьте сборку для переноса на ночь при комнатной температуре.
      16. После переноса мембрану сшивают с помощью УФ-излучения с общей выходной энергией 1 200 Дж/^см2.
      17. Для детектирования локуса ARS316 проводят южную блот-гибридизацию с использованием радиоактивных зондов, синтезированных с использованием референсной системы мечения ДНК.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все дальнейшие действия на льду, если не указано иное.
      18. В реакционной пробирке с низким связыванием разводят 25-40 нг ПЦР-фрагмента (зонда) в 19 мкл dH₂O и инкубируют при 95 °C в течение 5 мин. Остудить сразу на льду.
      19. Добавьте в пробирку по 1 мкл 500 мкМ dCTP, 500 мкМ dGTP и 500 мкМ dTTP.
      20. Добавьте 20 мкл буфера, содержащего случайные нуклеотидные гексамеры, поставляемые в комплекте.
      21. Добавьте в пробирку 5 мкл радиоактивно меченого нуклеотида [^α-32P] dATP. Выполняйте все действия, связанные с радиоактивно меченым материалом, в защищенной среде, одобренной для радиоактивности.
      22. Добавьте 1 мкл фрагмента Кленова и инкубируйте при 37 °C на термомиксере в течение 15 мин для синтеза одноцепочечной ДНК.
      23. Добавьте 5 мкл стоп-буфера, чтобы остановить реакцию.
      24. Центрифугируйте колонку исключения размера в течение 2 минут при 1 500 × g , чтобы удалить буфер хранения. Отбросьте поток и поместите колонку в новую трубку.
      25. Пропустите зондовую смесь через колонку, чтобы удалить неинкорпорированные радиоактивные нуклеотиды. Центрифуга в течение 30 с при давлении 1 500 × г для сбора зонда.
      26. Добавьте 150 мкл ДНК сперматозоидов лосося (1:100), чтобы заблокировать неспецифическое связывание зонда с мембраной.
      27. Инкубируйте смесь зондов при 95 °C в течение 5 мин для денатурации двухцепочечной ДНК.
      28. Заморозьте на льду в течение нескольких секунд и центрифугируйте в течение нескольких секунд при 500 × г , чтобы капли воды конденсировались на крышке.
      29. Кратковременно промывают южную блоттинговую мембрану буфером для гибридизации в течение 5-10 мин с ротацией.
      30. Предварительно гибридизируют мембрану с буфером для гибридизации в течение 1 ч при 55 °C с вращением. Откажитесь от буфера гибридизации.
      31. Добавьте 15 мл свежего буфера для гибридизации (предварительно подогретого до 55 °C) в мембрану вместе с подготовленным зондом. Инкубируйте мембрану в течение ночи при температуре 55 °C с вращением.
      32. Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,3x SSC, 0,1% SDS при 55 °C с вращением.
      33. Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,1x SSC, 0,1% SDS при 55 °C с вращением.
      34. Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,1x SSC, 1,5% SDS при 55 °C с вращением.
      35. Снимите мембрану с гибридизационной пробирки и подвергните мембрану воздействию люминографического экрана на срок до 3 дней, чтобы получить радиоактивные отпечатки на пленке.
      36. Получение изображений пленки с помощью системы лазерного сканирования с люминографической визуализацией.
2. Анализ белков
   1. Пробоподготовка
      1. Отрегулируйте все образцы белка до их окончательных объемов (200 мкл, 100 мкл, 100 мкл, 20 мкл и 20 мкл для образцов экстракта сырых клеток, входных, проточных, гранул и элюата соответственно), добавив 1 мкл β-меркаптоэтанола, буфер для образцов PAGE LDS (1x) и dH₂O.
      2. Денатурируют образцы при 95 °C в течение 5 мин.
   2. Вестерн-блоттинг-анализ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте SDS-PAGE и вестерн-блоттинг по стандартным протоколам^15,16.
      1. Загрузите 15 мкл каждого образца в каждую лунку геля SDS-PAGE толщиной 1,5 мм.
      2. Проводят иммуноокрашивание блота с использованием антител PAP (1:2 000) и LexA (1:1 000) с ночной инкубацией при 4 °C. Развести в 5% растворе сухого молока/ПБСТ.
         ПРИМЕЧАНИЕ: После ПАП-анализа блот может быть удален с помощью протокола мягкой стриппинга¹⁷ перед иммуноокрашиванием вторым антителом LexA.

Результаты

Очистка домена хроматина ARS316 ~1,4 kb была опосредована конститутивно экспрессируемым белком-адаптером LexA-TAP. В качестве отрицательного контроля мы проводили очистки с использованием изогенного штамма, экспрессирующего LexA-TAP, но не содержащего интегрированных RS и LexA-связывающих сайтов.

Обсуждение

Идентификация факторов и хроматинового ландшафта конкретной целевой области генома по-прежнему представляет собой серьезную проблему в исследованиях хроматина¹⁸. Этот протокол описывает эффективную систему специфического удаления и очистки различных доменов хроматина...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid			Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA			Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone	Carl Roth	5025.1	Section 2 Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac)	Sigma Aldrich	A7262	Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25%	Merck Millipore	533003	Section 6 Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate	Santa Cruz	Sc-29085	Section 2 Storage: Store at room temperature
Bacto agar	BD (VWR)	90000-760	Section 3 Storage: Store at room temperature
Bacto peptone	BD (VWR)	211820	Section 3 Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	07604	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit	ThermoFisher	34580	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate	Merck	1.06579.1000	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher	15508013	Section 4 Storage: Store at 4 °C
Ethanol	Merck	100983	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock)	Sigma Aldrich	G0625-1KG  /  5KG	Section 3 Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x)	BioLabs	B7024A	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Glusose	Sigma-Aldrich	G8270	Section Storage: Store at room temperature
Glycine	Carl Roth	.0079.4	Section 2 Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL)	Invitrogen	AM9510	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	PanReac AppliChem	182109.1211	Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc)	Bernd Kraft	15274.2600/C035	Section 4 Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266	Section 6 Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)	Invitrogen	2399549	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v)	Invitrogen	15593-031	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541	Section 4 Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)	Hartmann Analytic	SRP-203	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system	ThermoFisher	18428-011	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock)	SERVA	34140.03	Section 3 Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl)	Merck	K53710504142	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	Sigma-Aldrich	71402	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) )	Alfa Aesar	A11183	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium azide	Santa Cruz Biotechnology	sc-208393	Section 2 Storage: Store at -20 °C
Triethylamine	Sigma Aldrich	90340	Section 2 Storage: Store at room temperature
Tris base	Chem Cruz	SC-3715B	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	Section 4 Storage: Store at room temperature
Yeast extract	BD (VWR)	212720	Section 3 Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )	Biomol	Y2016.5	Section 3 Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE	Sigma Aldrich	Y1376	Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)	NEB	R0105S	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78446	Section 4 Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL)	SERVA	33756	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)	ThermoFisher	EN0531	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL)	NEB	P8112S	Section 5 Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads	Bioclone Inc.	FC-102	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Dry ice			Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Section 4
Microspin G-25 Columns	Cytiva	27-5325-01	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Parafilm	Merck	P7793	Section 4
Positive nylon membrane	Biozol	11MEMP0001	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)	Invitrogen	NP0336BOX	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting	Henke Sass Wolf	4200-000V0	Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)	Cytiva	3030-917	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody	Merck Millipore	06-719	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate	Invitrogen	G21234	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins	Sigma Aldrich	P1291-500UL	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies	Sigma	I5006-100MG	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT			Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			Section 7.1
Equipment
Coffee grinder	Gastroback	42601	Section 4
Dewar flask	NAL GENE	4150-2000	Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack	Invitrogen	12321D	Section 4, 5 and 6
Hybridization oven	Hybaid Mini10	Ri418	Section 2
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	Section 4 and 7.1
UV-crosslinker	Analytikjena	95-0174-02	Section 7.1