השילוב של מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית והידרוג'ל פיברין: פרוטוקול עיבוד

Summary

מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית (SVF) בשילוב עם הידרוג'ל פיברין מציע נשאות קלה ויעילה לתאי סטרומה ברי קיימא שמקורם בשומן עבור אינדיקציות שונות, כולל הנדסת רקמות או מטרות ריפוי פצעים. כאן, אנו מציגים את ההכנה של מבנה מכני SVF (mSVF)-פיברין הידרוג'ל למחקר תרגומי ויישום קליני.

Abstract

הפוטנציאל הרגנרטיבי של תאי סטרומה שמקורם בשומן (ASCs) זכה לתשומת לב משמעותית במחקר רגנרטיבי ותרגומי. בעבר, מיצוי תאים אלה מרקמת השומן דרש תהליך רב-שלבי מבוסס אנזימים, וכתוצאה מכך נוצר תמהיל תאים הטרוגניים המורכב מ-ACS ותאים אחרים, המכונים במשותף מקטע כלי הדם של סטרומה (SVF). פרוטוקולי בידוד מכניים SVF (mSVF) שהוצגו לאחרונה גוזלים פחות זמן ועוקפים חששות רגולטוריים. לאחרונה הצענו פרוטוקול שמייצר mSVF עשיר בתאי סטרומה המבוסס על שילוב של תחליב וצנטריפוגה. אחת הבעיות הנוכחיות ביישום mSVF לטיפול בפצעים היא היעדר פיגום המספק הגנה מפני מניפולציה מכנית והתייבשות. הידרוג'ל פיברין הוכח בעבר כנספח שימושי בהעברת תאים למטרות ריפוי פצעים. בעבודה שלהלן, אנו מתארים את שלבי ההכנה של מבנה הידרוג'ל mSVF-פיברין כגישה חדשנית למחקר תרגומי וליישום קליני.

Introduction

בשנים האחרונות, כירורגיה פלסטית רגנרטיבית התפתחה כנדבך נוסף של כירורגיה פלסטית¹. ניתוח פלסטי רגנרטיבי נועד לשקם רקמות פגועות על ידי העברת גורמים, תאים ורקמות מסיסים שנקצרו מהמטופל כדי לקדם שיקום רקמות באופן זעיר פולשני². תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) זכו לתשומת לב בשל יכולתם להתמיין לשושלות מזנכימליות מרובות, מה שהופך אותם למועמדים מבטיחים למחקר ברפואה רגנרטיבית³. פרופיל הציטוקינים שלהם מציג השפעות אנגיוגניות, מדכאות חיסון ונוגדות חמצון⁴.

באופן מסורתי, ASCs בודדו מרקמת השומן באמצעות גישה אנזימט....

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להצהרת הלסינקי. כל התורמים הבגירים נתנו הסכמה מדעת בכתב כדי לאפשר שימוש נוסף בדגימות הרקמה שנאספו. הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד שלנו.

1. קציר רקמת שומן

1. קצרו את רקמת השומן על ידי ביצוע שאיבת שומן סטנדרטית בטכניקת קצירת שומן קונבנציונלית שתוארה בפרסומים קודמים^26,27. הקפד להשתמש בתמיסת גידול המורכבת מלקטט ואפינפרין של רינגר רגיל ביחס של 1:200,000.
2. יש לבצע את שאיבת השומן עם צינורית שאיפה 4 מ"מ, תחת לחץ ורטט שליליים, לתוך שקית סטרילית. העבירו מיד את השומן שנקטף למעב....

תוצאות

בדיקת Resazurin
תחילה בחנו את יכולת הקיום של תאי mSVF במבחנה . לשם כך ערכנו בדיקת כדאיות של תאי רסזורין בימים 0, 3 ו-7. יכולת הקיום של התא בימים 0, 3 ו-7 מתוך ארבע דגימות בסך הכל מוצגת באיור 1. הערכים של יום 0 משמשים כבסיס והוגדרו כ- 100%. ביום השלישי, הבקרה ה.......

Discussion

הבידוד המכני של SVF מספק חלופה אלגנטית לגישה האנזימטית המסורתית ומציע גישה רחבה ליישום קליני²⁹. למעשה, mSVF, כפי שהוצע בכתב היד הנוכחי, כבר נמצא בשימוש קליני לטיפול בצלקות ברקמות רכות או כנספח להליכים קוסמטיים³⁰. הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה פשוטה ל.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL