기계적으로 분리된 Stromal Vascular Fraction과 Fibrin Hydrogel의 조합: 처리 프로토콜

요약

피브린 하이드로겔과 함께 기계적으로 분리된 기질 혈관 분획(SVF)은 조직 공학 및/또는 상처 치유 목적을 포함한 다양한 적응증에 대해 생존 가능한 지방 유래 기질 세포를 위한 쉽고 효율적인 운반체를 제공합니다. 여기에서는 중개 연구 및 임상 응용을 위한 기계적 SVF(mSVF)-피브린 하이드로겔 구조체의 준비를 제시합니다.

초록

지방 유래 기질 세포(ASC)의 재생 잠재력은 재생 및 중개 연구에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 과거에는 지방 조직에서 이러한 세포를 추출하려면 다단계 효소 기반 공정이 필요했기 때문에 ACS와 다른 세포로 구성된 이질적인 세포 혼합물이 생성되었으며, 이를 통칭하여 기질 혈관 분획(SVF)이라고 합니다. 최근에 도입된 기계적 SVF(mSVF) 분리 프로토콜은 시간이 덜 걸리고 규제 문제를 우회합니다. 우리는 최근에 유화와 원심분리의 조합을 기반으로 기질 세포가 풍부한 mSVF를 생성하는 프로토콜을 제안했습니다. 상처 치료 응용을 위한 mSVF 응용의 현재 문제 중 하나는 기계적 조작 및 건조로부터 보호하는 스캐폴드가 없다는 것입니다. 피브린 하이드로겔은 과거에 상처 치유 목적으로 세포 전달에 유용한 보조제로 밝혀졌습니다. 본 연구에서는 중개 연구 및 임상 응용을 위한 새로운 접근 방식으로서 mSVF-피브린 하이드로겔 구조체의 준비 단계를 설명합니다.

서문

지난 몇 년 동안 재생 성형 수술은 성형 수술의 또 다른 기둥으로 부상했습니다¹. 재생성형수술은 환자로부터 채취한 용해성 인자, 세포, 조직 등을 이식하여 손상된 조직을 복원하는 것을 목적으로 하며, 이를 통해 최소 침습적 방식으로 조직 복원을 촉진한다². 지방 유래 줄기세포(ASC)는 여러 중간엽 계통으로 분화할 수 있는 능력으로 인해 주목을 받고 있으며, 재생 의학 연구의 유망한 후보가 되고 있습니다³. 사이토카인 프로필은 혈관 신생, 면역 억제 및 항산화 효과를 나타냅니다⁴.

전통적으로 ASC는 콜라겐분해효소를 사용한 효소 접근법을 사용하여 지방 조직에서 분리하여 기질 혈관 분획(SVF)을 생성한 후 배양하여 ASC를 얻었습니다. 이러한 실험실 기반 기술은 비용과 시간이 많이 소요되며, 무엇보다도 엄격한 규제 제한이 적용되어 임상 번역을 복잡하게 만듭니다 ^5,6,7. 대조적으로, 기계적으로 분리된 기질 혈관 분획(mSVF) 프로토콜은 규제 문제를 우회할 뿐만 아니라 오염 위험을 최소화하는 임상적 이점을 제공합니다 ^8,9.

SVF를 기계적으로 분리하기 위한 수많은 프로토콜이 설명되었다¹⁰. 이 중 Tonnard 등이 발표한 시프팅 프로토콜(shifting protocol)은 재생외과 의사들 사이에서 가장 주목을 받고 있다¹¹. 리포아스피라(lipoaspirates)로 알려진 표준 지방 흡입 절차를 통해 수집된 지방은 연결 장치에 부착된 두 개의 휴대용 주사기 사이로 전달될 수 있으며, 그 결과 나노지방이라고 하는 액체 형태가 생성됩니다. 이러한 mSVF 분리 프로토콜의 명백한 이점에는 전체 절차가 잘 통제된 환경에서 수행되기 때문에 처리 시간 단축, 오염 위험 최소화, 즉각적인 임상 번역 가능성 등이 포함됩니다¹².

전임상 및 임상적 증거에 따르면 세포 생존력 및 상처 치유 특성을 포함한 mSVF의 특성은 표준 효소 분리 방법과 유사합니다¹². 쥐 및 쥐 모델에서 상처 치유를 촉진하는 mSVF의 잠재력은 Chen et al. 및 Sun et ^al.13,14의 생체 내 연구를 통해 검증되었습니다. 그러나 임상 환경에서 상처 치유에 관한 사용 가능한 데이터가 부족합니다. 한 연구 그룹이 하지 개방성 골절에 임플란트가 노출된 상처를 입은 83세 환자에게 자가 지방 이식을 시행했을 때 유망한 결과가 보고되었다¹⁵. 또한, Lu 등은 만성 상처가 있는 20명의 환자 코호트에서 mSVF와 음압상처 요법을 비교했다¹⁶. 그들의 연구 결과는 mSVF 치료가 음압 상처 치료에 비해 상처 치유 속도가 더 높다는 것을 밝혔다¹⁶. 언급된 두 연구 모두 mSVF를 단독으로 또는 겔과 함께 표적 상처 부위에 주입했습니다 ^15,16.

실제 시나리오에서 mSVF의 임상 적용은 수혜자 부위에서 예측할 수 없는 흡수율로 인해 제한적입니다^17,18. 스캐폴드는 세포 유지, 혈관화 및 주변 조직으로의 통합을 돕기 때문에 이 문제에 대한 해결책을 약속합니다 19,20,21. 피브린 하이드로겔은 외과 분야에서 일반적으로 사용되는 FDA 승인 도구이며 mSVF¹⁹의 효과적인 운반체로 나타났습니다. 피브린 겔은 세포 운반체로 기능하는 데 여러 가지 이점을 제공하는 생체 고분자 물질입니다 : 우수한 생체 적합성을 나타내고 세포 부착을 촉진하며 제어 가능한 방식으로 분해 할 수 있습니다 22,24,25. 또한, 염증 및 이물질 반응이 최소화되며 상처 치유의 자연적인 과정에서 쉽게 흡수됩니다²². 우리는 언급된 mSVF 세포의 다양한 재생 능력과 피브린 하이드로겔과의 유리한 조합이 상처 치유 과정을 향상시키는 혁신적인 접근 방식을 제공할 수 있다고 믿습니다. 전반적으로, 이 접근법은 생존 가능한 mSVF 세포의 효율적인 국소 전달을 허용합니다. 이로써 우리는 상처 치유 목적으로 적용하기 위한 피브린 하이드로겔과 mSVF를 결합한 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 모든 성인 기증자는 수집된 조직 샘플의 추가 사용을 허용하기 위해 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 지방 조직의 수확

1. 이전 간행물^26,27에 설명된 기존의 지방 수확 기술에서 표준 지방 흡입을 수행하여 지방 조직을 수확합니다. 일반 링거 젖산과 에피네프린으로 구성된 투메센트 용액을 1:200,000의 비율로 사용하십시오.
2. 4mm 흡인 캐뉼라로 음압과 진동 하에 멸균 백에 지방 흡입을 수행합니다. 채취한 지방을 즉시 실험실로 옮깁니다.

2. mSVF 절연

1. 세포 배양 후드에서 다음 단계(섹션 2 및 3)를 수행하여 무균 작업 영역을 제공합니다. 생물학적 안전 수준 2를 보장하기 위해 일반 실험실 가운과 장갑을 착용하십시오.
2. 배양 배지 준비: 고포도당 Dulbecco's Modified Eagles's Medium(DMEM) 500mL에 소 태아 혈청(FBS) 50mL, 페니실린-스트렙토마이신 5mL를 보충합니다.
3. 리포아스피레이트를 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
4. 리포아스피릿을 멸균된 20mL 루어락 주사기로 옮기고 1.4mm 커넥터를 부착합니다. 주사기 내부에 공기가 없는지 확인하십시오.
5. 두 번째 20mL 루어락 주사기를 1.4mm 커넥터의 반대쪽에 부착합니다.
6. 한 주사기의 지방 조직을 다른 주사기로 총 30회 밀어 넣습니다.
7. 유화된 지방을 새 50mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
8. 유화 된 지방을 500 x g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
9. 원심분리 후 유성 최상층을 버립니다. 그런 다음 중앙의 정제된 mSV 층을 수집합니다. 새 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 수성상을 버립니다.
10. 원심분리기 튜브에 배양 배지(2.2단계)를 최대 40mL 표시까지 채웁니다.
11. 원심분리기 튜브를 원심분리기에 넣고 다시 한 번 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
12. 생성된 mSVF 층을 수집하여 새로운 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

3. mSVF-피브린 하이드로겔 제조

1. 100μL의 mSVF와 10μL의 트롬빈(100U/mL), 10μL의 CaCl₂ (80mM) 및 70μL의 트라넥삼산(100mg/mL)을 멸균 1.5mL 튜브에 결합합니다.
2. 새 피펫 팁을 사용하여 적용 직전에 마지막 성분으로 10μL의 피브리노겐(100mg/mL)을 추가합니다. 하이드로겔 중합은 약 10-30초 이내에 관찰됩니다.
3. 임상적 적용을 위해, 국소 투여 직전에 이 마지막 단계를 수행하고, 가급적이면 침대 옆에서 수행하십시오. 분석 목적을 위해 피펫팅을 통해 12웰 플레이트로 옮깁니다.

4. 생존도 분석 및 조직학

1. 3.3단계에서 mSVF-하이드로겔 혼합물 200μL를 12웰 플레이트의 1웰에 피펫팅합니다.
2. mSVF-collection (단계 2.12)의 100 μL를 피펫팅하여 양성 대조군과 함께 하나의 웰에 넣습니다.
3. 피펫 200 μL의 피브린 하이드로겔을 음성 대조군으로 하나의 웰에만 넣습니다.
4. 12웰 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 의 일반 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.
5. 이 시간이 끝나면 각 웰에 1mL의 레자주린(알라마르 블루, 10% 농도, 배양 배지에 희석)을 추가합니다.
6. 첨가 후 12 웰 플레이트를 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 24 시간 동안 배양합니다.
7. 24시간 후 여기 파장 555nm와 방출 파장 596nm를 사용하는 세포 이미징 멀티모드 마이크로플레이트 리더를 사용하여 첫 번째 형광 강도를 측정합니다.
8. 3일과 7일에 연속적인 형광 강도 측정을 수행합니다.
9. 조직학적 평가가 필요한 경우 1일, 3일, 7일에 실험을 중지하고 피브린 하이드로겔을 4°C에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정합니다. 고정 후 1% 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고 4°C에서 보관합니다.
10. 하이드로겔을 최적의 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입하고 저온 유지 장치로 10μm 두께의 동결 블록을 절단합니다. 표준 프로토콜²⁸에 따라 hematoxylin 및 eosin(H&E) 용액으로 섹션을 염색합니다.

결과

Resazurin 분석
우리는 먼저 mSVF 세포의 시험관 내 세포 생존력을 조사했습니다. 이를 위해 0일, 3일, 7일에 레자주린 세포 생존력 분석을 수행했습니다. 총 4개의 샘플의 0일, 3일, 7일째의 세포 생존율이 그림 1에 나와 있습니다. 0일의 값은 기준선으로 사용되며 100%로 설정되었습니다. 3일째 양성대조군(mSVF)은 78.92%(± 5.33%)로 소폭 감...

토론

SVF의 기계적 분리는 전통적인 효소 접근법에 대한 우아한 대안을 제공하며 임상 적용을 위한 광범위한 접근을 제공한다²⁹. 실제로, 본 원고에서 제안된 바와 같이, mSVF는 이미 흉터의 연조직 치료를 위해 또는 미용 시술을 위한 보조제로서 임상적으로 사용되고 있다³⁰. 여기에 제시된 프로토콜은 생존 가능한 mSVF 세포의 효율적인 국소 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL