기계적으로 분리된 Stromal Vascular Fraction과 Fibrin Hydrogel의 조합: 처리 프로토콜

요약

피브린 하이드로겔과 함께 기계적으로 분리된 기질 혈관 분획(SVF)은 조직 공학 및/또는 상처 치유 목적을 포함한 다양한 적응증에 대해 생존 가능한 지방 유래 기질 세포를 위한 쉽고 효율적인 운반체를 제공합니다. 여기에서는 중개 연구 및 임상 응용을 위한 기계적 SVF(mSVF)-피브린 하이드로겔 구조체의 준비를 제시합니다.

초록

지방 유래 기질 세포(ASC)의 재생 잠재력은 재생 및 중개 연구에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 과거에는 지방 조직에서 이러한 세포를 추출하려면 다단계 효소 기반 공정이 필요했기 때문에 ACS와 다른 세포로 구성된 이질적인 세포 혼합물이 생성되었으며, 이를 통칭하여 기질 혈관 분획(SVF)이라고 합니다. 최근에 도입된 기계적 SVF(mSVF) 분리 프로토콜은 시간이 덜 걸리고 규제 문제를 우회합니다. 우리는 최근에 유화와 원심분리의 조합을 기반으로 기질 세포가 풍부한 mSVF를 생성하는 프로토콜을 제안했습니다. 상처 치료 응용을 위한 mSVF 응용의 현재 문제 중 하나는 기계적 조작 및 건조로부터 보호하는 스캐폴드가 없다는 것입니다. 피브린 하이드로겔은 과거에 상처 치유 목적으로 세포 전달에 유용한 보조제로 밝혀졌습니다. 본 연구에서는 중개 연구 및 임상 응용을 위한 새로운 접근 방식으로서 mSVF-피브린 하이드로겔 구조체의 준비 단계를 설명합니다.

서문

지난 몇 년 동안 재생 성형 수술은 성형 수술의 또 다른 기둥으로 부상했습니다¹. 재생성형수술은 환자로부터 채취한 용해성 인자, 세포, 조직 등을 이식하여 손상된 조직을 복원하는 것을 목적으로 하며, 이를 통해 최소 침습적 방식으로 조직 복원을 촉진한다². 지방 유래 줄기세포(ASC)는 여러 중간엽 계통으로 분화할 수 있는 능력으로 인해 주목을 받고 있으며, 재생 의학 연구의 유망한 후보가 되고 있습니다³. 사이토카인 프로필은 혈관 신생, 면역 억제 및 항산화 효과를 나타냅니다⁴.

전통적으로 ASC는 콜라겐분해효소를 사용한 효소 접근법을 사용하여 지방 조직에서 분리하여 기질 혈관 분획(SVF)을 생성한 후 배양하여 ASC를 얻었습니다. 이러한 실험실 기반 기술은 비용과 시간이 많이 소요되며, 무엇보다도 엄격한 규제 제한이 적용되어 임상 번역을 복잡하게 만듭니다 ^5,6,7<....

프로토콜

이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 모든 성인 기증자는 수집된 조직 샘플의 추가 사용을 허용하기 위해 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 지방 조직의 수확

1. 이전 간행물^26,27에 설명된 기존의 지방 수확 기술에서 표준 지방 흡입을 수행하여 지방 조직을 수확합니다. 일반 링거 젖산과 에피네프린으로 구성된 투메센트 용액을 1:200,000의 비율로 사용하십시오.
2. 4mm 흡인 캐뉼라로 음압과 진동 하에 멸균 백에 지방 흡입을 수행합니다. 채취한 지방을 즉시 실험실로 옮깁니다.

2. mSVF 절연

1. 세포 배양 후드에서 다음 단계(섹션 2 및 3)를 수행하여 무균 작업 영역을 제공합니다. 생물학적 안전 수준 2를 보장하기 위해 일반 실험실 가운과 장갑을 착용하십시오.
2. 배양 배지 준비: 고포도당 Dulbecco's Modif....

토론

SVF의 기계적 분리는 전통적인 효소 접근법에 대한 우아한 대안을 제공하며 임상 적용을 위한 광범위한 접근을 제공한다²⁹. 실제로, 본 원고에서 제안된 바와 같이, mSVF는 이미 흉터의 연조직 치료를 위해 또는 미용 시술을 위한 보조제로서 임상적으로 사용되고 있다³⁰. 여기에 제시된 프로토콜은 생존 가능한 mSVF 세포의 효율적인 국소 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL