Die Kombination aus mechanisch isolierter stromaler vaskulärer Fraktion und Fibrinhydrogel: Ein Verarbeitungsprotokoll

Zusammenfassung

Die mechanisch isolierte stromale Gefäßfraktion (SVF) in Kombination mit einem Fibrinhydrogel bietet einen einfachen und effizienten Träger für lebensfähige Stromazellen aus Fettgewebe für verschiedene Indikationen, einschließlich Tissue Engineering und/oder Wundheilungszwecke. Hier stellen wir die Herstellung eines mechanischen SVF (mSVF)-Fibrin-Hydrogel-Konstrukts für die translationale Forschung und klinische Anwendung vor.

Zusammenfassung

Das regenerative Potenzial von aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen (ASCs) hat in der regenerativen und translationalen Forschung große Aufmerksamkeit erregt. In der Vergangenheit erforderte die Extraktion dieser Zellen aus Fettgewebe einen mehrstufigen enzymbasierten Prozess, der zu einem heterogenen Zellmix aus ACS und anderen Zellen führte, der gemeinsam als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bezeichnet wird. Die kürzlich eingeführten mechanischen SVF-Isolationsprotokolle (mSVF) sind weniger zeitaufwändig und umgehen regulatorische Bedenken. Wir haben kürzlich ein Protokoll vorgeschlagen, das mSVF erzeugt, das reich an Stromazellen ist, basierend auf einer Kombination aus Emulgierung und Zentrifugation. Ein aktuelles Problem bei der mSVF-Anwendung in der Wundtherapie ist das Fehlen eines Gerüsts, das Schutz vor mechanischer Manipulation und Austrocknung bietet. In der Vergangenheit hat sich gezeigt, dass Fibrin-Hydrogele eine nützliche Ergänzung beim Zelltransfer zur Wundheilung sind. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir die Präparationsschritte eines mSVF-Fibrin-Hydrogel-Konstrukts als neuartigen Ansatz für die translationale Forschung und klinische Anwendung.

Einleitung

In den letzten Jahren hat sich die regenerative plastische Chirurgie zu einer zusätzlichen Säule der plastischen Chirurgie entwickelt¹. Die regenerative plastische Chirurgie zielt darauf ab, geschädigtes Gewebe wiederherzustellen, indem lösliche Faktoren, Zellen und Gewebe, die dem Patienten entnommen wurden, übertragen werden, um die Gewebewiederherstellung auf minimalinvasive Weise zu fördern². Aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCs) haben aufgrund ihrer Fähigkeit, sich in mehrere mesenchymale Linien zu differenzieren, Aufmerksamkeit erregt, was sie zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Forschung in der regenerativen Medizin macht³. Ihr Zytokinprofil zeigt angiogene, immunsuppressive und antioxidative Wirkungen⁴.

Traditionell wurden ASCs aus Fettgewebe unter Verwendung eines enzymatischen Ansatzes mit Kollagenase isoliert, was zu einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF) führte, die anschließend kultiviert wurde, um ASCs zu erhalten. Diese laborbasierten Technologien sind kostspielig, zeitaufwändig und unterliegen vor allem strengen regulatorischen Beschränkungen, was die klinische Umsetzung erschwert ^5,6,7. Im Gegensatz dazu bieten mechanisch isolierte Protokolle der stromalen vaskulären Fraktion (mSVF) den klinischen Vorteil, dass sie nicht nur regulatorische Probleme umgehen, sondern auch das Kontaminationsrisiko minimieren ^8,9.

Zahlreiche Protokolle zur mechanischen Isolierung der SVF wurden beschrieben¹⁰. Unter diesen hat das von Tonnard et al. veröffentlichte Shifting-Protokoll unter regenerativen Chirurgen die größte Aufmerksamkeit erregt¹¹. Das durch Standard-Fettabsaugungsverfahren gesammelte Fett, die als Lipoaspirate bekannt sind, kann zwischen zwei Handspritzen übertragen werden, die an einem Verbindungsgerät befestigt sind, wodurch eine flüssige Form entsteht, die als Nanofett bezeichnet wird. Zu den offensichtlichen Vorteilen dieser mSVF-Isolationsprotokolle gehören eine verkürzte Verarbeitungszeit, ein minimales Kontaminationsrisiko, da das gesamte Verfahren in einer gut kontrollierten Umgebung durchgeführt wird, und eine mögliche sofortige klinische Translation¹².

Präklinische und klinische Evidenz deutet darauf hin, dass die Eigenschaften von mSVF, einschließlich der Zellviabilität und der Wundheilungseigenschaften, mit Standardmethoden zur enzymatischen Isolierung vergleichbar sind¹². Das Potenzial von mSVF zur Förderung der Wundheilung in Ratten- und Mausmodellen wurde durch in vivo-Studien von Chen et al. und Sun et al. ^{validiert13,14}. Es gibt jedoch einen Mangel an verfügbaren Daten zur Wundheilung im klinischen Umfeld. Vielversprechende Ergebnisse wurden berichtet, als eine Studiengruppe eine Eigenfetttransplantation bei einem 83-jährigen Patienten durchführte, der eine Wunde mit einem freiliegenden Implantat in einer offenen Fraktur der unteren Extremität hatte¹⁵. Darüber hinaus führten Lu et al. einen Vergleich zwischen mSVF und Unterdruck-Wundtherapie in einer Kohorte von 20 Patienten mit chronischen Wunden durch¹⁶. Ihre Ergebnisse zeigten, dass die mSVF-Behandlung im Vergleich zur Unterdruck-Wundtherapie zu einer höheren Wundheilungsrate führte¹⁶. In beiden genannten Studien wurde mSVF allein oder in Kombination mit einem Gel in das Zielwundgebiet injiziert^15,16.

Im realen Szenario ist die klinische Anwendung von mSVF aufgrund unvorhersehbarer Absorptionsraten an den Empfängerstellen begrenzt^17,18. Gerüste versprechen Abhilfe für dieses Problem, da sie bei der Zellerhaltung, Vaskularisierung und Integration in das umgebende Gewebe helfen 19,20,21. Fibrin-Hydrogele sind ein häufig verwendetes, von der FDA zugelassenes Werkzeug, das in chirurgischen Disziplinen eingesetzt wird und sich als wirksamer Träger von mSVF¹⁹ erwiesen hat. Fibringel ist ein biopolymeres Material, das mehrere Vorteile bei der Funktion als Zellträger bietet: Es weist eine ausgezeichnete Biokompatibilität auf, fördert die Zelladhäsion und ist in der Lage, sich auf kontrollierbare Weise abzubauen 22,24,25. Darüber hinaus zeigt es minimale Entzündungs- und Fremdkörperreaktionen und wird im natürlichen Verlauf der Wundheilung leicht absorbiert²². Wir glauben, dass die erwähnten vielfältigen regenerativen Fähigkeiten von mSVF-Zellen und die vorteilhafte Kombination mit einem Fibrin-Hydrogel einen innovativen Ansatz zur Verbesserung der Wundheilungsprozesse bieten können. Insgesamt ermöglicht dieser Ansatz eine effiziente topische Verabreichung von lebensfähigen mSVF-Zellen. Wir stellen hiermit das Protokoll vor, das mSVF mit einem Fibrin-Hydrogel kombiniert, das für die Anwendung bei der Wundheilung bestimmt ist.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle erwachsenen Spender gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, um die weitere Verwendung der entnommenen Gewebeproben zu ermöglichen. Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung unserer Institution.

1. Entnahme von Fettgewebe

1. Gewinnen Sie das Fettgewebe, indem Sie eine Standard-Fettabsaugung in einer konventionellen Fettgewinnungstechnik durchführen, die in früheren Veröffentlichungen beschrieben wurde^26,27. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Tumeszenzlösung verwenden, die aus regulärem Ringer-Laktat und Adrenalin im Verhältnis 1: 200.000 besteht.
2. Führen Sie die Fettabsaugung mit einer 4 mm Aspirationskanüle unter Unterdruck und Vibration in einem sterilen Beutel durch. Übertragen Sie das geerntete Fett sofort ins Labor.

2. mSVF-Isolierung

1. Führen Sie die folgenden Schritte (Abschnitte 2 und 3) in einer Zellkulturhaube durch, um einen aseptischen Arbeitsbereich bereitzustellen. Tragen Sie einen normalen Laborkittel und Handschuhe, um die biologische Sicherheitsstufe 2 zu gewährleisten.
2. Bereiten Sie das Nährmedium vor: Ergänzen Sie 500 ml Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt mit 50 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin.
3. Übertragen Sie das Lipoaspirat in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
4. Übertragen Sie das Lipoaspirat in eine sterile 20-ml-Luer-Lock-Spritze und bringen Sie einen 1,4-mm-Konnektor an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Spritze befindet.
5. Befestigen Sie eine zweite 20-ml-Luer-Lock-Spritze an der kontralateralen Seite des 1,4-mm-Anschlusses.
6. Schieben Sie das Fettgewebe insgesamt 30 Mal von einer Spritze in die andere.
7. Übertragen Sie das emulgierte Fett in ein frisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
8. Das emulgierte Fett bei 500 x g 10 min zentrifugieren.
9. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren die ölige Deckschicht. Sammeln Sie dann die zentrale gereinigte mSV-Schicht. Füllen Sie es in ein frisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen und verwerfen Sie die wässrige Phase.
10. Füllen Sie das Zentrifugenröhrchen mit Nährmedium (aus Schritt 2.2) bis zur 40-ml-Markierung.
11. Setzen Sie das Zentrifugenröhrchen in die Zentrifuge ein und zentrifugieren Sie erneut bei 500 x g für 5 min.
12. Sammeln Sie die resultierende mSVF-Schicht und übertragen Sie sie in ein neues 50-mL-Zentrifugenröhrchen.

3. Herstellung von mSVF-Fibrin-Hydrogel

1. Kombinieren Sie 100 μl mSVF mit 10 μl Thrombin (100 U/ml), 10 μl CaCl₂ (80 mM) und 70 μl Tranexamsäure (100 mg/ml) in einem sterilen 1,5 ml-Röhrchen.
2. Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze, um kurz vor der Anwendung 10 μl Fibrinogen (100 mg/ml) als letzte Komponente hinzuzufügen. Beachten Sie, dass die Hydrogel-Polymerisation innerhalb von ca. 10-30 s beobachtet wird.
3. Für die klinische Anwendung führen Sie diesen letzten Schritt kurz vor der topischen Verabreichung durch, vorzugsweise am Krankenbett. Zu Analysezwecken durch Pipettieren in eine 12-Well-Platte umfüllen.

4. Viabilitätsassay und Histologie

1. Pipettieren Sie 200 μl des mSVF-Hydrogel-Gemisches aus Schritt 3.3 in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte.
2. 100 μl der mSVF-Sammlung (Schritt 2.12.) als Positivkontrolle in eine Vertiefung pipettieren.
3. Pipettieren Sie 200 μl Fibrinhydrogel nur in eine Vertiefung als Negativkontrolle.
4. Stellen Sie die 12-Well-Platte 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen normalen Inkubator.
5. Nach dieser Zeit 1 ml Resazurin (Alamarblau, 10 % Konzentration, in Kulturmedium verdünnt) in jede Vertiefung geben.
6. Nach der Zugabe wird die 12-Well-Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ 24 h inkubiert.
7. Messen Sie nach 24 Stunden die erste Fluoreszenzintensität mit einem Multimode-Mikroplatten-Reader für die Zellbildgebung mit einer Anregungswellenlänge von 555 nm und einer Emissionswellenlänge von 596 nm.
8. Führen Sie an den Tagen 3 und 7 aufeinanderfolgende Fluoreszenzintensitätsmessungen durch.
9. Wenn eine histologische Beurteilung erforderlich ist, beenden Sie den Versuch an den Tagen 1, 3 und 7 und fixieren Sie das Fibrinhydrogel in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C für 24 h. Nach der Fixierung 1 % phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben und bei 4 °C lagern.
10. Betten Sie die Hydrogele in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein und schneiden Sie gefrorene Blöcke mit einer Dicke von 10 μm mit einem Kryostaten. Die Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E)-Lösung gemäß den Standardprotokollen²⁸ gefärbt.

Ergebnisse

Resazurin-Assay
Wir untersuchten zunächst die in vitro Zellviabilität der mSVF-Zellen. Zu diesem Zweck führten wir an den Tagen 0, 3 und 7 einen Resazurin-Zellviabilitätsassay durch. Die Zellviabilität an den Tagen 0, 3 und 7 von insgesamt vier Proben ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Werte von Tag 0 dienen als Ausgangswert und wurden auf 100 % festgelegt. An Tag 3 zeigte die Positivkontrolle (mSVF) einen leichten Rückgan...

Diskussion

Die mechanische Isolierung von SVF bietet eine elegante Alternative zum traditionellen enzymatischen Ansatz und bietet einen breiten Zugang für die klinische Anwendung²⁹. Tatsächlich wird die mSVF, wie sie in der vorliegenden Handschrift vorgeschlagen wird, bereits klinisch zur Weichteilbehandlung von Narben oder als Ergänzung zu kosmetischen Eingriffen^{eingesetzt 30}. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine einfache Methode für die e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL