A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
הוראת המדעים הביולוגיים יכולה להיות מגרה יותר עבור התלמידים באמצעות שימוש בניסויים. כתב יד זה מציג שני פרוטוקולים שונים אך משלימים שניתן להשתמש בהם בכיתה כדי לעודד תלמידים לנסח ולבדוק השערות הקשורות לתזונה עתירת קלוריות, רעב והזדקנות.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא נמטודה שקופה, לא טפילית עם ביולוגיה פשוטה, מה שהופך אותה לכלי נהדר להוראת מדעי הביולוגיה באמצעות צביעת התאים או התוכן המולקולרי שלהם. צבע לוגול (תמיסת יוד-אשלגן יודיד) נמצא בשימוש נרחב בביוכימיה כדי להכתים מאגרי גליקוגן. בהקשר זה ניתן להבחין בהבדלים בין בעלי חיים מוזנים למורעבים, מלבד ההשפעות של תנאים שונים, כגון דיאטות שונות ורמות חמצן שונות. Erioglaucine הוא צבע כחול המציין את אובדן מחסום המעי. כאשר מחסום המעי שלם, הצבע הכחול מכתים בתוך הלומן; עם זאת, כאשר שלמות זו מופרעת, הצבע דולף לתוך חלל הגוף. באמצעות סטריאומיקרוסקופ או מיקרוסקופ, מורים יכולים להדגים שינויים פיזיולוגיים וביוכימיים, או שהם יכולים לעורר תלמידים לשאול שאלה מדעית ולהעלות השערות ולבחון את ההשערה שלהם באמצעות בדיקות אלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי טכניקות צביעה ב- C. elegans שיכולות להתבצע בקלות על ידי תלמידים.
הוראת המדעים הביולוגיים בתיכון היא אתגר מתמשך. יש לציין כי הגישה והשימוש בטכנולוגיה הביאו להתקדמות חשובה בתהליך ההוראה-למידה, אולם כלים כגון צ'טבוטים של בינה מלאכותית מקשים על רציונליזציה וחיפוש ראיות בשל תגובות קלות (ולעיתים שגויות) המתקבלות1. בגלל זה, השימוש בשיטה מדעית עם ניסויים מעשיים בגישה מבוססת חקירה בכיתה היא אסטרטגיה חשובה לפתח או לעורר חשיבה ביקורתית, יצירתיות, ומיומנויות טכניות אצל התלמידים2.
בהקשר זה, הנמטודה החיה החופשית Caenorhabditis elegans שימשה בהצלחה בניסויים למטרות הוראה3 בגלל יתרונותיה המיוחדים: היא אינה טפיל וה - Escherichia coli המשמש להאכלה הוא ברמת בטיחות ביולוגית -1, ולכן מפחית קרוב לאפס את הסיכון הביולוגי; יש לו תנועת תנועה אלגנטית וניתנת לכימות, שמעניינת את התלמידים להתבונן; וזה שקוף, אשר מאפשר תצפית איברים, אלא גם מכתים עם פיגמנטים שיכולים להצביע על נוכחות של biomolecules או התרחשות של שינויים פיזיולוגיים4. לכן, ניתן לשער ולבדוק בכיתה הנחות פשוטות הקשורות לביוכימיה ושינויים פיזיולוגיים כגון הזדקנות.
גליקוגן הוא פחממת אחסון, הנוצרת על ידי שרשרת ארוכה ומסועפת של מולקולות גלוקוז שנוצרו על ידי שאריות גלוקוזיל עם (1→4)-α קשרים ליניאריים גליקוזידים ו (1→6)-α קשרים גליקוזידים בנקודות הסתעפות והוא חשוב במיוחד להתכווצות שרירים, התמיינות תאים ושמירה על גליקמיה5. גליקוגן מסונתז לאחר האכלה עקב הפעלת אינסולין של האנזים גליקוגן סינתאז. במהלך פעילות גופנית או צום, אפינפרין או גלוקגון, בהתאמה, מפעילים גליקוגן פוספורילאז, ולכן, לשבור את פוליסכריד כדי לספק גלוקוז-6-פוספט לתאי השריר או לשחרר גלוקוז חופשי כדי לעקוף היפוגליקמיה 6,7. שינויים ברמות הגליקוגן משפיעים על התמיינות תאים, איתות, ויסות חמצון-חיזור וגבעול במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים שונים, כולל סרטן8. ב C. elegans, גליקוגן נמצא בעיקר בשרירי הוושט, היפודרמיס, מעי, נוירונים ובעיקר בשרירי דופן הגוף9. ניתן למדוד את תכולת הגליקוגן באמצעות תמיסת יוד של לוגול, שכן יוד נקשר לסלילים הסליליים ויוצר קומפלקס יוד-גליקוגן, מה שנותן צבע כחול-שחור או חום-שחור חד נראה לעין, אשר שימש בהצלחה להדגמת תכולת הגליקוגן ב- C. elegans10. הוכח כי הצטברות גליקוגן הנגרמת על ידי הזנת גלוקוז גבוהה יכולה להפחית את תוחלת החיים של התולעת, ולכן להאיץ את תהליך ההזדקנות11,12. בנוסף, הפרעות מטבוליות, הורמונים אחרים וחשיפה לקסנוביוטיקה יכולים לשנות את חילוף החומרים של הגליקוגן גם כן13,14. לכן, ניסויים על תכולת הגליקוגן ב- C. elegans מעניינים למדי, שכן גורמים מגוונים עשויים להפריע לחילוף החומרים שלו ויכולים לעורר דיון בכיתה על ביוכימיה בסיסית הקשורה לנושאים רוחביים כגון פעילות גופנית, דיאטה, מחלות והזדקנות.
הזדקנות היא ירידה תפקודית תלוית זמן הנגרמת על ידי נזק תאי. נזק זה יכול להיות קשור לעקה חמצונית, שחיקת טלומרים, אובדן פרוטאוסטזיס, דלקת ואפילו על ידי הצטברות של גופים פוליגלוקוזיים בלתי מסיסים15, רק כדי להזכיר כמה. אחד מסימני ההיכר של ההזדקנות הוא הפחתת שלמות המעי, הקשורים למספר מצבים כרוניים המתרחשים במהלך חייו של אורגניזם16. שמירה על הומאוסטזיס המעי תלויה בשלמות אפיתל המעי, אשר נתמך על ידי חלבונים צומת היוצרים מחסום פיזי וחיבור תאי אפיתל סמוכים. כאשר יש נזק אפיתל זה, דליפה של תוכן לומינלי לתוך interstitium מתרחשת17. בהתבסס על מנגנון זה, בדיקת הדרדסים שימשה לאימות שלמות המעי במספר מודלים של בעלי חיים, שכן צבע כחול זה מלח דיסודיום אריוגלאוצין אינו חוצה את קרום המעי, ונותר בלומן18. כאשר תולעים נגועות בפתוגן, מזוהמות עם כמה רעילים או גיל, שינוי שלמות interstitial, הצבע חוצה את המחסום ומתפשט על כל התולעת, אשר הופך להיות כחול כולו. בדיקה זו מאפשרת דיון על הפיזיולוגיה של ההזדקנות והתנסות בגורמים שיכולים להאיץ או לעכב תהליך זה על ידי חשיפת תולעים לתנאים שונים. הפרוטוקולים כאן יתארו בפירוט את שתי השיטות הללו, מבוססות צבע, שניתן לעשות בקלות בכיתה כדי לעורר ולעורר את התלמידים לנסח ולבדוק השערות הקשורות לביוכימיה ופיזיולוגיה.
החלק הראשון של הפרוטוקול מראה את תחולתו לנתח איכותית וכמותית את תכולת הגליקוגן במודל C. elegans 10. מטרת החלק השני של הפרוטוקול היא להעריך את שלמות המעי של C. elegans. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר הזדקנות C. elegans על ידי הערכת שלמות קרומי המעי. יתר על כן, הוא מאפשר להעריך אם חומר מאיץ או מעכב הזדקנות ואם חומרים כלשהם יש פוטנציאל רעיל על מחסום המעי19.
זן C. elegans ששימש במחקר הנוכחי היה מסוג בריסטול N2 פראי. עם זאת, ניתן לשכפל את ההליך באמצעות זנים בעלי שיעורי גדילה דומים, או להתאים את השיטה בהתאם לצורך בהחלפת ציוד, בהתחשב בכך שיש להם תפקיד זהה או דומה, או בהתאם לזן בו נעשה שימוש, שכן לזנים מסוימים יש דרישות תחזוקה ו / או רגישות ספציפיות; ניתן לקבל מידע זה ממרכז Caenorhabditis Genetics Center (CGC) או מאתר WormBase. שינויים אלה לא אמורים להשפיע על יכולת השחזור של השיטה.
הערה: ניתן להשיג חיידקי Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) וזני בר מסוג Bristol N2 מ-CGC, אוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב או מתרומה ממעבדת C. elegans . למען בטיחות החוקרים, חובה להשתמש בציוד מגן אישי. למרות שהריכוזים של ריאגנטים כמו היפוכלוריט ונתרן הידרוקסידי נמוכים, חיוני ללבוש את ה- PPE המומלץ, כפי שמודגש בכתב היד, כדי למזער את כל הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים לכימיקלים אלה.
1. תכולת הגליקוגן
איור 1: סכמת תכולת הגליקוגן הכוללת ב-C. elegans. סכמטי של הניסוי שבוצע כאן לביצוע בדיקת תכולת הגליקוגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
2. הערכת חדירות המעי
איור 2: סכמת בדיקת חדירות מעיים כוללת ב- C. elegans. (א) הכנת ג. אלגנס . (B) צביעה במלח דיסודיום אריוגלאוצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בדיקת תכולת הגליקוגן מספקת שיטה חזקה ומהירה לסינון תנאי בדיקה שונים, כגון מחקרים השוואתיים של זנים שונים שעשויים להשפיע על סינתזת הגליקוגן או פירוקו. במחקר זה, תולעי L4 עברו שלושה תנאי בדיקה שונים: צום, האכלה וקבוצות מועשרות בגלוקוז. הבדיקה בוצעה שלוש פעמים, כאשר כל תנאי ש...
לסיכום, פרוטוקול זה מספק הערכה איכותית של תכולת הגליקוגן בתולעי C. elegans בודדות באמצעות צביעת לוגול: בדיקה פשוטה, חזקה ומהירה. צביעת לוגול היא גישה נטולת תוויות ולא פולשנית המאפשרת רכישת נתונים מולקולריים ברזולוציות תת-תאיות, ומאפשרת ניטור תנודות בתכולת הגליקוגן בתו?...
למחברים אין מה לחשוף.
D.S.A מכירה במימון מ- Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brazil), מספר מענק #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brazil), מספר מענק, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, קוד מימון 001 עבור N.S.J ו- A.C.S)
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microtubes | Local suppliers | - | |
37-degree incubator | KS 4000i | 97014-816 | |
50 mL conical tube | Local suppliers | - | |
6 cm Petri plates | Local suppliers | - | |
Agar bacteriological | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 9002-18-0 | |
C. elegans Bristol N2 (wild type) | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | - | |
CaCL2 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 10035-04-8 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 57-88-5 | |
D-(+)-Glucose anhydrous | Neon | 50-99-7 | |
Distilled H2O | Local suppliers | - | |
Erioglaucine disodium salt | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 3844-45-9 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | - | |
Flow hood | Mylabor | ||
Incubator | Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA. | - | |
KH2PO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7778-77-0 | |
Levamisole hydrochloride | RIPERCOL L 150F | - | |
Lugol solution | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | L6146 | |
MgSO4 | Synth | S1063-01-AH | |
Microcentrifuge | Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany | ||
Na2HPO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7558-79-4 | |
NaCl | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7647-14-5 | |
Nystatin | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | N6261 | |
Peptone bacteriological | êxodo científica | 91079-38-8 | |
Stereomicroscope | Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil) | ||
Streptomycin Sulfate | Estreptomax | - |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved