예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 글리코겐 축적 및 장 무결성을 시각화하기 위한 저비용 염료 사용

요약

생물학을 가르치는 것은 실험을 통해 학생들에게 더 자극을 줄 수 있습니다. 이 원고는 학생들이 고칼로리 다이어트, 굶주림 및 노화와 관련된 가설을 공식화하고 테스트하도록 장려하기 위해 교실에서 사용할 수 있는 두 가지 다르지만 보완적인 프로토콜을 제시합니다.

초록

예쁜꼬마선충(C. elegans )은 생물학이 간단하여 투명하고 기생충이 없는 선충으로, 세포 또는 세포의 분자 함량을 염색하여 생물학 교육에 유용한 도구입니다. Lugol 염료(요오드-요오드화 칼륨 용액)는 글리코겐 저장을 염색하기 위해 생화학에서 널리 사용되었습니다. 이러한 맥락에서 다른 식단 및 산소 수치와 같은 다른 조건의 영향 외에도 먹이를 먹은 동물과 굶주린 동물 간의 차이를 관찰할 수 있습니다. 에리오글라우신(Erioglaucine)은 장 장벽의 손실을 나타내는 파란색 염료입니다. 장 장벽이 손상되지 않으면 파란색 염료가 내강 내부에 얼룩이 생깁니다. 그러나 이러한 무결성이 파괴되면 염료가 체강 내로 누출됩니다. 교사는 실체현미경이나 현미경을 사용하여 생리학적 및 생화학적 변화를 시연하거나 학생들이 과학적 질문을 하고 이러한 분석을 사용하여 가설을 세우고 테스트하도록 유도할 수 있습니다. 본 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans )에서 학생들이 쉽게 수행할 수 있는 두 가지 염색 기법을 설명합니다.

서문

고등학교에서 생물학을 가르치는 것은 끊임없는 도전입니다. 주목할 만한 점은, 기술의 접근과 사용은 교수-학습 과정에 중요한 발전을 가져왔지만, 인공 지능 챗봇과 같은 도구는 쉽게(때로는 부정확한) 응답을 얻기 때문에 합리화하고 증거를 찾는 것을 더 어렵게 만듭니다¹. 그렇기 때문에 교실에서 탐구 기반 접근 방식에서 실제 실험과 함께 과학적 방법을 사용하는 것은 학생들의 비판적 사고, 창의성 및 기술적 기술을 개발하거나 자극하는 중요한 전략입니다².

이러한 맥락에서, 자유로운 살아있는 선충 Caenorhabditis elegans 는 다음과 같은 특별한^{장점 때문에 교육} 목적3을 위한 실험에 성공적으로 사용되어 왔다: 그것은 기생충이 아니며 먹이에 사용되는 대장균 은 생물안전 레벨 1이므로 생물학적 위험을 거의 0에 가깝게 줄인다. 그것은 우아하고 정량화 가능한 운동 움직임을 가지고 있어 학생들이 관찰하는 것이 흥미롭습니다. 그리고 투명하여 장기 관찰이 가능하지만 생체 분자의 존재 또는 생리적 변화의 발생을 나타낼 수 있는 색소....

프로토콜

참고 : 대장균 OP50 (E. coli OP50) 박테리아 및 Bristol N2 야생형 균주는 CGC, University of Minnesota, USA 또는 C. elegans 실험실의 기증을 통해 얻을 수 있습니다. 연구자의 안전을 위해 개인 보호 장비를 사용하는 것이 필수적입니다. 차아염소산염 및 수산화나트륨과 같은 시약의 농도는 낮지만 이러한 화학 물질과 관련된 잠재적 위험을 최소화하기 위해 원고에서 강조한 대로 권장되는 PPE를 착용하는 것이 중요합니다.

1. 글리코겐 함량

1. 테스트 플레이트 준비
   1. 웜 균주당 6개의 60mm x 15mm NGM 한천 플레이트²⁰개( 보충 표 1에 설명된 대로 선충 성장 매체 한천, NGM 10mL)를 준비하고 실온에서 1일 동안 건조시킵니다. 오염을 방지하기 위해 플레이트를 닫아 두십시오.
   2. 플레이트당 200μL의 E. coli OP50 액체 배양액(광학 밀도 = 0.600, 대략 600nm의 파장에서)을 추가하여 플로우 후드....

토론

요약하면, 이 프로토콜은 Lugol 염색을 사용하여 개별 예쁜꼬마선충(C. elegans worms)의 글리코겐 함량에 대한 정성적 평가를 제공합니다: 간단하고 강력하며 신속한 분석법입니다. Lugol 염색은 세포 내 해상도에서 분자 데이터의 획득을 용이하게 하는 무표지 및 비침습적 접근 방식으로, 단일 웜 내에서 글리코겐 함량 변동을 모니터링할 수 있습니다(¹⁰

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Local suppliers	-
37-degree incubator	KS 4000i	97014-816
50 mL conical tube	Local suppliers	-
6 cm Petri plates	Local suppliers	-
Agar bacteriological	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (wild type)	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
CaCL2	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	10035-04-8
Cholesterol	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	57-88-5
D-(+)-Glucose anhydrous	Neon	50-99-7
Distilled H2O	Local suppliers	-
Erioglaucine disodium salt	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	3844-45-9
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
Flow hood	Mylabor
Incubator	Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA.	-
KH2PO4	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	7778-77-0
Levamisole hydrochloride	RIPERCOL L 150F	-
Lugol solution	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	L6146
MgSO4	Synth	S1063-01-AH
Microcentrifuge	Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany
Na2HPO4	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	7558-79-4
NaCl	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	7647-14-5
Nystatin	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	N6261
Peptone bacteriological	êxodo científica	91079-38-8
Stereomicroscope	Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil)
Streptomycin Sulfate	Estreptomax	-