Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Biyolojik bilimlerin öğretilmesi, deneylerin kullanılmasıyla öğrenciler için daha teşvik edici hale getirilebilir. Bu el yazması, öğrencileri yüksek kalorili diyetler, açlık ve yaşlanma ile ilgili hipotezleri formüle etmeye ve test etmeye teşvik etmek için sınıfta kullanılabilecek iki farklı ancak tamamlayıcı protokol sunmaktadır.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), basit bir biyolojiye sahip şeffaf, parazitik olmayan bir nematoddur, bu da onu hücrelerin boyanması veya moleküler içerikleri yoluyla biyolojik bilimler öğretimi için harika bir araç haline getirir. Lugol boyası (iyot-potasyum iyodür çözeltisi), biyokimyada glikojen depolarını lekelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bağlamda, beslenen ve aç bırakılan hayvanlar arasında, farklı diyetler ve oksijen seviyeleri gibi farklı koşulların etkilerinin yanı sıra farklılıklar gözlemlemek mümkündür. Erioglausin, bağırsak bariyerinin kaybını gösteren mavi bir boyadır. Bağırsak bariyeri sağlam olduğunda, mavi boya lümenin içinde lekelenir; Ancak bu bütünlük bozulduğunda boya vücut boşluğuna sızar. Stereomikroskop veya mikroskop kullanarak, öğretmenler fizyolojik ve biyokimyasal değişiklikleri gösterebilir veya öğrencileri bilimsel bir soru sormaya ve bu tahlilleri kullanarak hipotezlerini hipotez kurmaya ve test etmeye teşvik edebilirler. Bu protokol, C. elegans'ta öğrenciler tarafından kolayca uygulanabilecek iki boyama tekniğini tanımlamaktadır.
Lisede biyolojik bilimler öğretimi sürekli bir zorluktur. Özellikle, teknolojiye erişim ve kullanım, öğretme-öğrenme sürecinde önemli ilerlemeler sağlamıştır, ancak yapay zeka sohbet robotları gibi araçlar, elde edilen kolay (ve bazen yanlış) yanıtlar nedeniyle rasyonalize etmeyi ve kanıt aramayı daha zor hale getirmektedir1. Bu nedenle, sınıfta sorgulamaya dayalı bir yaklaşımda pratik deneylerle bilimsel bir yöntemin kullanılması, öğrencilerde eleştirel düşünme, yaratıcılık ve teknik becerileri geliştirmek veya teşvik etmek için önemli bir stratejidir2.
Bu bağlamda, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , özel avantajları nedeniyleöğretim amaçlı deneylerde 3 başarıyla kullanılmıştır: Bir parazit değildir ve beslenme için kullanılan Escherichia coli biyogüvenlik seviyesi-1'dir, bu nedenle biyolojik tehlikeyi sıfıra yakın azaltır; Öğrencilerin gözlemlemesi ilginç olan zarif ve ölçülebilir bir hareket hareketine sahiptir; Ve şeffaftır, bu da organ gözlemine izin verir, aynı zamanda biyomoleküllerin varlığını veya fizyolojik değişikliklerin meydana geldiğini gösterebilen pigmentlerle boyanır4. Bu nedenle, biyokimya ve yaşlanma gibi fizyolojik değişikliklerle ilgili basit varsayımları sınıfta hipotez kurmak ve test etmek mümkündür.
Glikojen, dal noktalarında (1→4)-α glikozidik lineer bağlara ve (1→6)-α glikozidik bağlara sahip glukozil kalıntıları tarafından oluşturulan uzun ve dallı bir glikoz molekülleri zinciri tarafından oluşturulan bir depo karbonhidratıdır ve özellikle kas kasılması, hücre farklılaşması ve glisemi bakımı için önemlidir5. Glikojen, glikojen-sentaz enziminin insülin aktivasyonu nedeniyle beslenmeden sonra sentezlenir. Egzersiz veya oruç sırasında, sırasıyla epinefrin veya glukagon, glikojen fosforilazı aktive eder ve bu nedenle, kas hücrelerine glikoz-6-fosfat sağlamak için polisakkariti parçalar veya hipoglisemiyi atlatmak için serbest glikoz salgılar 6,7. Glikojen seviyelerindeki değişiklikler, kanser de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında hücre farklılaşmasını, sinyalizasyonunu, redoks regülasyonunu ve saplılığını etkiler8. C. elegans'ta glikojen esas olarak yemek borusu kası, hipodermis, bağırsak, nöronlar ve esas olarak vücut duvarı kaslarındabulunur 9. Glikojen içeriği, Lugol'ün İyot çözeltisi kullanılarak ölçülebilir, çünkü iyot, bir iyot-glikojen kompleksi oluşturan sarmal bobinlere bağlanır ve görünür keskin mavi-siyah veya kahverengi-siyah bir renk verir, bu da glikojen içeriğini göstermek için başarıyla kullanılmıştır. Yüksek glikoz beslemesinin neden olduğu glikojen birikiminin solucanın ömrünü kısaltabildiği ve dolayısıyla yaşlanma sürecini hızlandırdığı gösterilmiştir11,12. Ek olarak, metabolik bozukluklar, diğer hormonlar ve ksenobiyotiklere maruz kalma, glikojen metabolizmasını da değiştirebilir13,14. Bu nedenle, C. elegans'taki glikojen içeriği üzerine deneyler oldukça ilginçtir, çünkü çeşitli faktörler metabolizmasını bozabilir ve egzersiz, diyetler, hastalıklar ve yaşlanma gibi enine temalarla ilişkili temel biyokimya hakkında sınıf içi bir tartışmayı teşvik edebilir.
Yaşlanma, hücresel hasarın neden olduğu zamana bağlı fonksiyonel bir düşüştür. Bu hasar, oksidatif stres, telomer aşınması, proteostaz kaybı, iltihaplanma ve hatta çözünmeyen poliglukozan cisimciklerinin15 birikmesi ile ilişkilendirilebilir. Yaşlanmanın ayırt edici özelliklerinden biri, bir organizmanın yaşamı boyunca ortaya çıkan çeşitli kronik durumlarla ilişkili bağırsak bütünlüğünün azalmasıdır16. Bağırsak homeostazının sürdürülmesi, fiziksel bir bariyer oluşturan ve bitişik epitel hücrelerini birbirine bağlayan bağlantı proteinleri tarafından desteklenen bağırsak epitelinin bütünlüğüne bağlıdır. Bu epitelde hasar olduğunda, luminal içeriğin interstisyuma sızması meydana gelir17. Bu mekanizmaya dayanarak, şirin testi, birkaç hayvan modelinde bağırsak bütünlüğünü doğrulamak için kullanılmıştır, çünkü bu mavi boya Erioglaucine disodyum tuzu, lümende18 kalan bağırsak zarını geçmez. Solucanlar bir patojenle enfekte olduğunda, bazı toksik maddelerle kontamine olduğunda veya yaşlandığında, interstisyel bütünlüğü değiştirdiğinde, boya bariyeri geçer ve solucanın her tarafına yayılır ve bu da tamamen mavi olur. Bu tahlil, yaşlanmanın fizyolojisi hakkında tartışmaya ve solucanları farklı koşullara maruz bırakarak bu süreci hızlandırabilecek veya geciktirebilecek faktörler üzerinde deneyler yapmaya izin verir. Buradaki protokoller, öğrencileri biyokimya ve fizyoloji ile ilgili hipotezleri formüle etmeye ve test etmeye teşvik etmek ve teşvik etmek için sınıfta kolayca yapılabilecek bu iki boya bazlı yöntemi ayrıntılı olarak açıklayacaktır.
Protokolün ilk kısmı, C. elegans model10'daki glikojen içeriğini kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmenin uygulanabilirliğini göstermektedir. Protokolün ikinci bölümünün amacı C. elegans bağırsağının bütünlüğünü değerlendirmektir. Bu teknik, bağırsak zarlarının bütünlüğünü değerlendirerek C. elegans yaşlanmasının izlenmesine izin verir. Ayrıca, bir maddenin yaşlanmayı hızlandırıp hızlandırmadığını veya geciktirip geciktirmediğini ve herhangi bir maddenin bağırsak bariyeri19 üzerinde toksik potansiyele sahip olup olmadığını değerlendirmeye izin verir.
Bu çalışma için kullanılan C. elegans suşu, Bristol N2 yabani tipidir. Bununla birlikte, prosedür, karşılaştırılabilir büyüme oranları sergileyen suşlar kullanılarak tekrarlanabilir veya yöntem, aynı veya benzer işleve sahip oldukları göz önünde bulundurularak veya kullanılan suşa bağlı olarak, belirli suşların özel bakım ve/veya hassasiyet gereksinimlerine sahip olması nedeniyle, ekipman değiştirme ihtiyacına göre ayarlanmalıdır; bu bilgiler Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) veya WormBase web sitesinden edinilebilir. Bu değişiklikler yöntemin tekrarlanabilirliğini etkilememelidir.
NOT: Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) bakterileri ve Bristol N2 yabani tip suşları, CGC, Minnesota Üniversitesi, ABD'den veya bir C. elegans laboratuvarından bağış yoluyla elde edilebilir. Araştırmacıların güvenliği için Kişisel Koruyucu Donanımların kullanılması zorunludur. Hipoklorit ve sodyum hidroksit gibi reaktiflerin konsantrasyonları düşük olsa da, bu kimyasallarla ilişkili potansiyel riskleri en aza indirmek için makalede vurgulandığı gibi önerilen KKD'nin giyilmesi önemlidir.
1. Glikojen içeriği
Şekil 1: C. elegans'ta genel glikojen içeriği analizi şeması. Glikojen içerik testini gerçekleştirmek için burada gerçekleştirilen deneyin bir şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi
Şekil 2: C. elegans'ta genel bağırsak geçirgenlik deneyi şeması. (A) C. elegans hazırlığı. (B) Erioglaucine disodyum tuzu ile boyama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Glikojen içeriği analizi, glikojen sentezini veya bozunmasını etkileyebilecek farklı suşların karşılaştırmalı çalışmaları gibi çeşitli test koşullarının taranması için sağlam ve hızlı bir yöntem sağlar. Bu çalışmada, L4 solucanları üç farklı test koşuluna tabi tutuldu: açlık, beslenme ve glikozla zenginleştirilmiş gruplar. Test üç kez gerçekleştirildi ve her koşul her testte iki kez tekrarlandı; Şekil 3'te temsi...
Özetle, bu protokol, Lugol boyaması kullanılarak tek tek C. elegans solucanlarındaki glikojen içeriğinin kalitatif bir değerlendirmesini sağlar: basit, sağlam ve hızlı bir test. Lugol boyama, hücre altı çözünürlüklerde moleküler verilerin elde edilmesini kolaylaştıran, tek solucanlar10 içindeki glikojen içeriği dalgalanmalarının izlenmesine izin veren, etiketsiz ve invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Ayrıca tahlil, minimum ekipm...
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
DSA, Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brezilya), hibe numarası #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brezilya), hibe numarası, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior'dan (CAPES, N.S.J ve ACS için Finans Kodu 001) fon sağladığını kabul eder
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microtubes | Local suppliers | - | |
37-degree incubator | KS 4000i | 97014-816 | |
50 mL conical tube | Local suppliers | - | |
6 cm Petri plates | Local suppliers | - | |
Agar bacteriological | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 9002-18-0 | |
C. elegans Bristol N2 (wild type) | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | - | |
CaCL2 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 10035-04-8 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 57-88-5 | |
D-(+)-Glucose anhydrous | Neon | 50-99-7 | |
Distilled H2O | Local suppliers | - | |
Erioglaucine disodium salt | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 3844-45-9 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | - | |
Flow hood | Mylabor | ||
Incubator | Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA. | - | |
KH2PO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7778-77-0 | |
Levamisole hydrochloride | RIPERCOL L 150F | - | |
Lugol solution | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | L6146 | |
MgSO4 | Synth | S1063-01-AH | |
Microcentrifuge | Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany | ||
Na2HPO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7558-79-4 | |
NaCl | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7647-14-5 | |
Nystatin | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | N6261 | |
Peptone bacteriological | êxodo científica | 91079-38-8 | |
Stereomicroscope | Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil) | ||
Streptomycin Sulfate | Estreptomax | - |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır