È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
L'insegnamento delle scienze biologiche può essere reso più stimolante per gli studenti attraverso l'uso della sperimentazione. Questo manoscritto presenta due protocolli diversi ma complementari che possono essere utilizzati in classe per incoraggiare gli studenti a formulare e testare ipotesi relative alle diete ipercaloriche, alla fame e all'invecchiamento.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un nematode trasparente, non parassitario, con una biologia semplice, che lo rende un ottimo strumento per l'insegnamento delle scienze biologiche attraverso la colorazione delle cellule o il loro contenuto molecolare. Il colorante Lugol (soluzione iodio-ioduro di potassio) è stato ampiamente utilizzato in biochimica per colorare le riserve di glicogeno. In questo contesto, è possibile osservare differenze tra animali nutriti e affamati, oltre agli effetti di diverse condizioni, come diete diverse e livelli di ossigeno. L'erioglaucina è un colorante blu che indica la perdita della barriera intestinale. Quando la barriera intestinale è intatta, il colorante blu si macchia all'interno del lume; Tuttavia, quando questa integrità viene interrotta, il colorante fuoriesce nella cavità del corpo. Utilizzando uno stereomicroscopio o un microscopio, gli insegnanti possono dimostrare alterazioni fisiologiche e biochimiche, oppure possono istigare gli studenti a porre una domanda scientifica e ipotizzare e testare la loro ipotesi utilizzando questi saggi. Il presente protocollo descrive due tecniche di colorazione in C. elegans che possono essere facilmente eseguite dagli studenti.
L'insegnamento delle scienze biologiche nelle scuole superiori è una sfida continua. In particolare, l'accesso e l'uso della tecnologia hanno portato importanti progressi nel processo di insegnamento-apprendimento, tuttavia, strumenti come i chatbot di intelligenza artificiale rendono più difficile la razionalizzazione e la ricerca di prove a causa delle risposte facili (e talvolta errate) ottenute1. Per questo motivo, l'uso di un metodo scientifico con sperimentazione pratica in un approccio basato sull'indagine in classe è una strategia importante per sviluppare o stimolare il pensiero critico, la creatività e le competenze tecniche negli studenti2.
In questo contesto, il nematode a vita libera Caenorhabditis elegans è stato utilizzato con successo nella sperimentazione a scopo didattico3 a causa dei suoi particolari vantaggi: non è un parassita e l'Escherichia coli utilizzato per l'alimentazione è di livello di biosicurezza-1, riducendo quindi quasi a zero il rischio biologico; ha un movimento di locomozione elegante e quantificabile, che è interessante da osservare per gli studenti; ed è trasparente, il che consente l'osservazione d'organo, ma anche la colorazione con pigmenti che possono indicare la presenza di biomolecole o l'insorgenza di alterazioni fisiologiche4. Pertanto, è possibile ipotizzare e testare in aula semplici postulati legati alla biochimica e ai cambiamenti fisiologici come l'invecchiamento.
Il glicogeno è un carboidrato di deposito, formato da una lunga e ramificata catena di molecole di glucosio formata da residui glucosilici con legami lineari glicosidici (1→4)-α e legami glicosidici (1→6)-α nei punti di ramificazione ed è particolarmente importante per la contrazione muscolare, la differenziazione cellulare e il mantenimento della glicemia5. Il glicogeno viene sintetizzato dopo l'alimentazione a causa dell'attivazione insulinica dell'enzima glicogeno-sintasi. Durante l'esercizio fisico o il digiuno, l'epinefrina o il glucagone, rispettivamente, attivano la glicogeno fosforilasi e, quindi, scompongono il polisaccaride per fornire glucosio-6-fosfato alle cellule muscolari o rilasciano glucosio libero per eludere l'ipoglicemia 6,7. Le alterazioni dei livelli di glicogeno influiscono sulla differenziazione cellulare, sulla segnalazione, sulla regolazione redox e sulla staminalità in varie condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, incluso il cancro8. In C. elegans, il glicogeno si trova principalmente nel muscolo esofageo, nell'ipoderma, nell'intestino, nei neuroni e principalmente nei muscoli della parete corporea9. Il contenuto di glicogeno può essere misurato utilizzando la soluzione di iodio di Lugol, poiché lo iodio si lega nelle bobine elicoidali formando un complesso iodio-glicogeno, dando un colore blu-nero o marrone-nero visibile e nitido, che è stato utilizzato con successo per dimostrare il contenuto di glicogeno in C. elegans10. È stato dimostrato che l'accumulo di glicogeno causato dall'alimentazione ad alto contenuto di glucosio può ridurre la durata della vita dei vermi, accelerando quindi il processo di invecchiamento11,12. Inoltre, i disturbi metabolici, altri ormoni e l'esposizione agli xenobiotici possono alterare anche il metabolismo del glicogeno 13,14. Pertanto, la sperimentazione sul contenuto di glicogeno in C. elegans è piuttosto interessante, poiché diversi fattori possono disturbare il suo metabolismo e possono stimolare una discussione in classe sulla biochimica di base associata a temi trasversali come l'esercizio fisico, le diete, le malattie e l'invecchiamento.
L'invecchiamento è un declino funzionale dipendente dal tempo causato da un danno cellulare. Questo danno può essere associato a stress ossidativo, attrito dei telomeri, perdita di proteostasi, infiammazione e persino dall'accumulo di corpi poliglucosani insolubili15, solo per citarne alcuni. Uno dei tratti distintivi dell'invecchiamento è la riduzione dell'integrità intestinale, associata a diverse condizioni croniche che si verificano durante la vita di un organismo16. Il mantenimento dell'omeostasi intestinale dipende dall'integrità dell'epitelio intestinale, che è supportato da proteine giunzionali che formano una barriera fisica e collegano le cellule epiteliali adiacenti. Quando c'è un danno a questo epitelio, si verifica una fuoriuscita di contenuto luminale nell'interstizio17. Sulla base di questo meccanismo, il test puffo è stato utilizzato per verificare l'integrità intestinale in diversi modelli animali, poiché questo colorante blu sale disodico Erioglaucina non attraversa la membrana intestinale, rimanendo nel lume18. Quando i vermi vengono infettati da un agente patogeno, contaminati da alcune sostanze tossiche o invecchiano, alterando l'integrità interstiziale, il colorante attraversa la barriera e si diffonde su tutto il verme, che diventa tutto blu. Questo test consente di discutere sulla fisiologia dell'invecchiamento e di sperimentare i fattori che possono accelerare o ritardare questo processo esponendo i vermi a diverse condizioni. I protocolli qui descritti descriveranno in dettaglio questi due metodi basati sui coloranti che possono essere facilmente eseguiti in classe per istigare e stimolare gli studenti a formulare e testare ipotesi relative alla biochimica e alla fisiologia.
La prima parte del protocollo mostra la sua applicabilità per analizzare qualitativamente e quantitativamente il contenuto di glicogeno nel modello10 di C. elegans. Lo scopo della seconda parte del protocollo è quello di valutare l'integrità dell'intestino di C. elegans. Questa tecnica consente di monitorare l'invecchiamento di C. elegans valutando l'integrità delle membrane intestinali. Inoltre, consente di valutare se una sostanza accelera o ritarda l'invecchiamento e se alcune sostanze hanno un potenziale tossico sulla barriera intestinale19.
Il ceppo di C. elegans utilizzato per il presente studio era Bristol N2 wild type. Tuttavia, la procedura può essere replicata utilizzando ceppi che presentano tassi di crescita comparabili, oppure il metodo deve essere adattato in base alla necessità di sostituzione dell'apparecchiatura, considerando che hanno la stessa funzione o simile, o a seconda del ceppo utilizzato, poiché alcuni ceppi hanno requisiti specifici di manutenzione e/o sensibilità; queste informazioni possono essere ottenute dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) o dal sito web di WormBase. Queste modifiche non dovrebbero influire sulla riproducibilità del metodo.
NOTA: I batteri Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) e i ceppi wild type Bristol N2 possono essere ottenuti dal CGC, Università del Minnesota, USA o da donazione da un laboratorio di C. elegans . Per la sicurezza dei ricercatori, è imperativo utilizzare dispositivi di protezione individuale. Sebbene le concentrazioni di reagenti come l'ipoclorito e l'idrossido di sodio siano basse, è essenziale indossare i DPI raccomandati, come evidenziato nel manoscritto, per ridurre al minimo i potenziali rischi associati a queste sostanze chimiche.
1. Contenuto di glicogeno
Figura 1: Schema del saggio del contenuto complessivo di glicogeno in C. elegans. Uno schema dell'esperimento qui eseguito per eseguire il saggio del contenuto di glicogeno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Valutazione della permeabilità intestinale
Figura 2: Schema del saggio di permeabilità intestinale complessiva in C. elegans. (A) Preparazione di C. elegans . (B) Colorazione con sale disodico di erioglaucina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il test del contenuto di glicogeno fornisce un metodo robusto e rapido per lo screening di varie condizioni di test, come studi comparativi di diversi ceppi che possono influenzare la sintesi o la degradazione del glicogeno. In questo studio, i vermi L4 sono stati sottoposti a tre distinte condizioni di test: digiuno, alimentazione e gruppi arricchiti di glucosio. Il test è stato eseguito tre volte, con ogni condizione replicata due volte in ogni test; un'immagine rappresentativa è mos...
In sintesi, questo protocollo fornisce una valutazione qualitativa del contenuto di glicogeno nei singoli vermi C. elegans utilizzando la colorazione Lugol: un test semplice, robusto e rapido. La colorazione Lugol è un approccio label-free e non invasivo che facilita l'acquisizione di dati molecolari a risoluzioni subcellulari, consentendo il monitoraggio delle fluttuazioni del contenuto di glicogeno all'interno di singoli vermi10. Inoltre, il test offre...
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
D.S.A riconosce il finanziamento da Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brasile), numero di sovvenzione #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brasile), numero di sovvenzione, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Codice finanziario 001 per N.S.J e A.C.S)
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microtubes | Local suppliers | - | |
37-degree incubator | KS 4000i | 97014-816 | |
50 mL conical tube | Local suppliers | - | |
6 cm Petri plates | Local suppliers | - | |
Agar bacteriological | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 9002-18-0 | |
C. elegans Bristol N2 (wild type) | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | - | |
CaCL2 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 10035-04-8 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 57-88-5 | |
D-(+)-Glucose anhydrous | Neon | 50-99-7 | |
Distilled H2O | Local suppliers | - | |
Erioglaucine disodium salt | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 3844-45-9 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | - | |
Flow hood | Mylabor | ||
Incubator | Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA. | - | |
KH2PO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7778-77-0 | |
Levamisole hydrochloride | RIPERCOL L 150F | - | |
Lugol solution | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | L6146 | |
MgSO4 | Synth | S1063-01-AH | |
Microcentrifuge | Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany | ||
Na2HPO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7558-79-4 | |
NaCl | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7647-14-5 | |
Nystatin | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | N6261 | |
Peptone bacteriological | êxodo científica | 91079-38-8 | |
Stereomicroscope | Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil) | ||
Streptomycin Sulfate | Estreptomax | - |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon