אלקטרומיוגרפיה מגורה של סיב יחיד (SFEMG) להערכת העברת צומת עצבית-שרירית במודלים של מכרסמים

Summary

במחקר זה, אנו מדגימים פרוטוקול אלקטרומיוגרפיה מעודן של סיב יחיד (SFEMG) כדי לאפשר מדידה in vivo של העברת צומת עצבית-שרירית (NMJ) במודלים של מכרסמים. גישה שלב אחר שלב לטכניקת SFEMG מתוארת כדי לאפשר כימות של השתנות העברת NMJ וכישלון בשריר גסטרוקנמיוס חולדה.

Abstract

כחיבור הסופי בין מערכת העצבים לשריר, העברה בצומת הנוירומוסקולרית (NMJ) חיונית לתפקוד מוטורי תקין. אלקטרומיוגרפיה של סיב יחיד (SFEMG) היא טכניקה רלוונטית ורגישה מבחינה קלינית המודדת תגובות פוטנציאליות לפעולה של סיבי שריר בודדים במהלך התכווצויות רצוניות או גירויים עצביים כדי להעריך את העברת NMJ. ההערכה והכימות של שידור NMJ כוללים שני פרמטרים: ריצוד וחסימה. ריצוד מתייחס לשונות בתזמון (השהיה) בין פוטנציאלי פעולה עוקבים של סיב יחיד (SFAPs). חסימה מסמלת את הכישלון של שידור NMJ ליזום תגובת SFAP. למרות SFEMG הוא מבחן מבוסס ורגיש היטב במסגרות קליניות, היישום שלה במחקר פרה-קליני היה נדיר יחסית. דו"ח זה מתאר את השלבים והקריטריונים המשמשים בביצוע SFEMG מגורה לכימות ריצוד וחסימה במודלים של מכרסמים. ניתן להשתמש בטכניקה זו במחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי לקבל תובנות לגבי תפקוד NMJ בהקשר של בריאות, הזדקנות ומחלות.

Introduction

אלקטרומיוגרפיה של סיב יחיד (SFEMG) פותחה לראשונה על ידי Stålberg ו-Ekstedt בשנות ה-60 של המאה ה-20 כדי לזהות ולנתח פוטנציאלי פעולה מסיבי שריר בודדים, בעיקר כדי לחקור עייפות שרירים¹. SFEMG היא הטכניקה הקלינית הרגישה ביותר להערכת העברת צומת נוירומוסקולרית (NMJ)². SFEMG מתבצע על ידי רישום סלקטיבי של פוטנציאלי פעולה של סיב יחיד (SFAPs)³. העברת NMJ יכולה להיפגע עקב גורמים כמו הזדקנות ^4,5 והפרעות נוירומוסקולריות שונות כגון myasthenia gravis וטרשת אמיוטרופית צידית⁶. יתר על כן, מצבים כגון איסכמיה, תנודות בטמפרטורה ושימוש בחומרים חוסמים עצביים-שריריים יכולים לגרום לליקויים בהעברת NMJ, המתבטאים בהשתנות מוגברת של שידור NMJ והתרחשויות של כשל NMJ².

ישנן שתי גישות להקלטת SFEMG: SFEMG מגורה ומרצון. SFEMG מרצון כרוך ברישום SFAPs משני NMJs שסופקו על ידי אותו אקסון מנוע באמצעות אלקטרודת מחט קונצנטרית המוחדרת לשריר הנבדק במהלך הפעלה רצונית⁷. בהתאם לכך, SFEMG מרצון דורש שיתוף פעולה מצד הנבדק ויכול להעריך רק יחידות מוטוריות בסף נמוך (אלה המופעלות במהלך צירים חלשים)³. SFEMG מגורה משתמש בזוג אלקטרודות מעוררות כדי לעורר אקסונים מוטוריים תוך הקלטת SFAPs עם אלקטרודת מחט SFEMG המוחדרת לשריר הנבדק⁷.

הן ב- SFEMG מרצון והן ב- gremulated, ריצוד וחסימה הם שני הפרמטרים המשמשים להערכה וכימות של שידור NMJ⁸. Jitter מתאר את השונות בתזמון (השהיה) בין SFAPs עוקבים. במהלך SFEMG מרצון, הריצוד מכומת על ידי הערכת הבדלי ההשהיה בין זוג SFAPs (המסופקים על ידי אותו אקסון מנועי) במהלך 50 עד 100 פריקות רצופות. במהלך SFEMG מגורה, הריצוד מכומת על ידי הערכת הבדלי ההשהיה בין תזמון הגירוי לבין תחילת SFAP במהלך 50 עד 100 פריקות רצופות. חסימה מצביעה על כישלון של שידור NMJ להפעיל תגובת SFAP, וניתן לכמת אותה כנוכחות או היעדר של כל זוג SFAPs במהלך SFEMG מרצון או עבור כל NMJ במהלך SFEMG^{מגורה 2,7}.

בעוד בדיקה מבוססת ורגישה במסגרת הקלינית, SFEMG יושמה רק לעתים רחוקות במחקר פרה-קליני 4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . בדו"ח זה אנו מתארים את הגישה לביצוע וניתוח רישומי SFEMG במודלים פרה-קליניים של מכרסמים. יתר על כן, אנו מציגים נתונים מייצגים המדגישים ממצאים מייצגים על SFEMG המצביעים על פגיעה בהעברת NMJ בעקבות מתן חומר חוסם נוירומוסקולרי שאינו מקטב, רוקורוניום.

Protocol

כל הפרוטוקולים אושרו ובוצעו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מיזורי.

1. הכנת בעלי חיים ומתן הרדמה

1. לבשו ציוד מיגון אישי מתאים.
2. לפני ההליך, מדדו את משקל החולדה כדי לקבוע את המינון המתאים לתרופות מבוססות משקל ולמכונות הנשמה.
3. יש להשרות הרדמה עם איזופלורן בשאיפה של 3%-5%. לאחר שנקבעה רמת הרדמה נאותה, מקמו את החולדה במצב נוטה ושמרו על הרדמה עם איזופלורן בשאיפה של 1%-3%.
4. ודא את הלימות עומק ההרדמה על ידי לחיצה עדינה על כרית כף הרגל האחורית עם מלקחיים כדי לבחון היעדר תגובת נסיגה.
5. שמור על טמפרטורת הגוף ב 37 °C (77 °F).
6. יש למרוח משחה על בסיס נפט המאושרת על ידי וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי התבוננות בקצב הנשימה והערכת תגובות נסיגה בעת הפעלת לחץ על כרית כף הרגל באמצעות מלקחיים.
7. לגלח את הגפה האחורית כדי להיות מוערך באמצעות קוצץ. לאחר הסרת שיער נאותה, באמצעות סרט הדבקה, מקם את האיבר שיש לחקור כאשר הקרסול מקובע על 90° dorsiflexion בקירוב, הברך בהארכה, ואת הירך בחטיפה.
8. עקוב ברציפות אחר הנשימה וקצב הלב של החולדה במהלך כל הניסוי.
   הערה: עלייה בקצב הלב משמשת בדרך כלל כאינדיקטור לעומק הרדמה לא מספיק.
9. מתן isoflurane כדי להרדים את החולדה, עם מינון של 5% או יותר, עד הנשימה נפסק לפחות 3 דקות. אשר את המתת החסד על ידי עריפת ראש.

2. מיקום אלקטרודות והגדרתן

הערה: שידור NMJ של העצב הסיאטי ושריר הגסטרוקנמיוס מוערכים באמצעות מערכת אלקטרומיוגרפיה (EMG). עיין בטבלת החומרים.

1. הכנס זוג מחטים מונופולריות מבודדות 28 G לגירוי העצב הסיאטי עם הקתודה לאזור הגפה האחורית הפרוקסימלית, בעוד האנודה קרובה יותר בתוך הרקמה התת עורית המכסה את העצה.
2. ודא שהאלקטרודות המעוררות אינן ממוקמות בסמיכות מיידית לעצב הסיאטי או עמוק מדי כדי למנוע נזק ישיר לעצב הסיאטי או למבנים סמוכים אחרים.
3. הניחו אלקטרודת טחון חד פעמית על הגפה האחורית או הזנב הנגדית.
4. הניחו בזהירות אלקטרודת מחט בקוטר 27 מ"מ בקוטר 25 מ"מ שתוכננה במיוחד עבור EMG סיב יחיד, הכוללת משטח הקלטה עשוי מחומר פלטינה-אירידיום לתוך שריר הגסטרוקנמיוס הימני. ודא כי אלקטרודות SFEMG autoclaved לפני כל שימוש כדי לשמור על סטריליות.
5. הכנס את אלקטרודת מחט SFEMG במקביל לסיבי שריר הגסטרוקנמיוס כדי ללכוד פוטנציאלי פעולה של סיב יחיד (SFAPs).
6. הימנע מנזק לשרירים בעת החדרה ותמרון של מחט SFEMG בתוך השריר.

3. הליך אלקטרומיוגרפיה מגורה של סיב יחיד (SFEMG)

1. יש להפעיל גירוי זרם קבוע על העצב הסיאטי הימני בתדר 10 הרץ באמצעות טווח עוצמה של 0.3-10 mA ומשך דופק של 0.1 ms.
2. הגדר את הגדרות המסנן בתוך מסנן בתדר נמוך של 1 kHz ומסנן בתדר גבוה של 10 kHz. התאם את הרווח מ- 200 μV ל- 1000 μV לכל חלוקה כדי להקל על הדמיה של פוטנציאלים. הגדר את מהירות הטאטוא על 500 μs לכל חלוקה.
3. התאם את עוצמת הגירוי כדי להפעיל ולבודד SFAPs להקלטה ולניתוח שלאחר מכן.
   1. כדי לזהות ולנתח תגובה כ- SFAP, ודא שהקריטריונים הספציפיים המוזכרים להלן מתקיימים: ודא שזמן העלייה מהשיא הבסיסי לשלב השלילי קטן מ- 500 μs, המשרעת המינימלית (משיא הבסיס לשלילי) היא לפחות 200 μV, והתגובה מציגה באופן עקבי התנהגות של הכל או אף אחד (גודל וצורה יציבים בין התגובות).
      הערה: חיוני שהתגובות החוזרות יציגו שלבים עקביים כלפי מעלה ללא חריצים או נקודות נטייה. שים לב שהקריטריון האחרון הוא קריטי להבחנה בין אות איכות לבין סיכום של אותות מרובים.
4. חשב ריצוד, או שונות של חביון SFAP (הזמן בין גירוי לשלב עולה של שיא שלילי של SFAP) בין פריקות רצופות, לאחר לפחות 50 גירויים (50-100 גירויים), ולהעריך ולכמת חסימה.
   הערה: ניתן להעריך חסימה כנוכחות או היעדר בכל סינפסה או כאחוז הגירויים שאינם מצליחים לעורר פוטנציאל פעולה של סיב יחיד. ריצוד מחושב באמצעות המשוואה הבאה⁷ (ריצוד מחושב בדרך כלל באופן אוטומטי על ידי מערכות אלקטרומיוגרפיה קליניות):
   
   MCD = ערך ממוצע של הפרש עוקב
   IPI = מרווח אינטרפוטנציאלי
5. חזור על התהליך לקבלת תגובות SFAP נוספות. בממוצע, להעריך 10 סינפסות מכל חיה כדי לחשב ריצוד ולאחר מכן לקבוע את הערכים הממוצעים לכל חיה.
6. אל תכלול SFAPs עם ריצוד של פחות מ- 4 μs מהניתוחים כדי למנוע הכללה של פוטנציאלים שעשויים היו להתעורר על ידי גירוי שרירים ישיר¹¹.
7. בעת רישום פוטנציאלים המציגים חסימה לסירוגין, הגדל את עוצמת הגירוי כדי לוודא שכשל SFAP אינו מיוחס לגירוי תת-מקסימלי.

תוצאות

כדי להדגים ריצוד מוגבר וחסימה בהקשר של כישלון שידור NMJ, SFEMG מגורה בוצע עם וללא מתן תוך ורידי של רוקורוניום. Rocuronium הוא סוכן חוסם נוירומוסקולרי שאינו פועל בפעולה בינונית, ללא דפולריזציה, הנמצא בשימוש נרחב במסגרות קליניות כדי לגרום לשיתוק שרירים במהלך ניתוחים או הליכים רפוא...

Discussion

SFEMG משמש בדרך כלל לבדיקות אבחון בחולים עם חשד לצורות אוטואימוניות, נרכשות וגנטיות של מחלת NMJ. SFEMG נחשב הבדיקה הרגישה ביותר לאבחון של הפרעת NMJ, myasthenia gravis^20,21. גירוי עצבי חוזר (RNS) היא שיטה נוספת הנפוצה יותר בבדיקות אבחון קליניות וכוללת גירוי עצב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G Reusable Single Fiber Needle Electrode	Technomed	202860-000	singlefiber recording electrode
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare	NA
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Rat Endotracheal Tubes (16 G)	Kent Scientific Corporation
Rocoronium Bromide	Sigma	PHR2397-500MG	neuromuscular blocker agent
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA	NA	portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury