АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании мы демонстрируем усовершенствованный протокол одноволоконной электромиографии (SFEMG), позволяющий in vivo измерять передачу нервно-мышечного соединения (NMJ) на моделях грызунов. Описан пошаговый подход к методу SFEMG, позволяющий количественно оценить вариабельность и сбой передачи NMJ в икроножной мышце крысы.

Аннотация

Являясь конечным связующим звеном между нервной системой и мышцами, передача в нервно-мышечном соединении (НМЖ) имеет решающее значение для нормальной двигательной функции. Электромиография одного волокна (SFEMG) является клинически значимым и чувствительным методом, который измеряет потенциальные реакции одного мышечного волокна во время произвольных сокращений или стимуляции нервов для оценки передачи NMJ. Оценка и количественная оценка передачи NMJ включает в себя два параметра: джиттер и блокировку. Джиттер относится к изменчивости во времени (задержке) между последовательными потенциалами действия одного волокна (SFAP). Блокировка означает неспособность передачи NMJ инициировать ответ SFAP. Несмотря на то, что SFEMG является хорошо зарекомендовавшим себя и чувствительным тестом в клинических условиях, его применение в доклинических исследованиях было относительно редким. В этом отчете изложены шаги и критерии, используемые при выполнении стимулированного SFEMG для количественной оценки джиттера и блокировки в моделях грызунов. Этот метод может быть использован в доклинических и клинических исследованиях для получения представления о функции NMJ в контексте здоровья, старения и болезней.

Введение

Одноволоконная электромиография (SFEMG) была первоначально разработана Столбергом и Экстедтом в 1960-х годах для идентификации и анализа потенциалов действия отдельных мышечных волокон, в первую очередь для изучения мышечнойусталости. SFEMG является наиболее чувствительным клиническим методом для оценки передачи нервно-мышечного соединения (NMJ)2. SFEMG проводится путем селективной регистрации потенциалов действия одного волокна (SFAP)3. Передача NMJ может быть нарушена из-за таких факторов, как старение 4,5 и различные нервно-мышечные расстройства, такие как миастения и боковой амиотрофический склероз6. Кроме того, такие состояния, как ишемия, колебания температуры и использование нервно-мышечных блокаторов, могут привести к дефициту передачи NMJ, проявляющемуся в повышенной вариабельности передачи NMJ и возникновении неудачи NMJ2.

Существует два подхода к регистрации SFEMG: стимулированный и добровольный SFEMG. Добровольная SFEMG включает в себя регистрацию SFAP от двух NMJ, подаваемых одним и тем же моторным аксоном, с помощью концентрического игольчатого электрода, вводимого в исследуемую мышцу во время произвольной активации7. Соответственно, добровольная СФЭМГ требует сотрудничества со стороны испытуемого и может оценить только низкопороговые двигательные единицы (активизируемые при слабых сокращениях)3. Стимулированный SFEMG использует пару стимулирующих электродов для стимуляции моторных аксонов во время регистрации SFAP с помощью игольчатого электрода SFEMG, вставленного в исследуемую мышцу7.

Как в произвольном, так и в вынужденном SFEMG джиттер и блокировка являются двумя параметрами, используемыми для оценки и количественного определения передачи NMJ8. Джиттер описывает изменчивость во времени (задержке) между последовательными SFAP. Во время добровольного SFEMG джиттер количественно оценивается путем оценки разницы в латентности между парой SFAP (подаваемых одним и тем же моторным аксоном) в течение от 50 до 100 последовательных разрядов. Во время стимулированной SFEMG джиттер количественно оценивается путем оценки разницы в латентности между временем стимуляции и началом SFAP в течение от 50 до 100 последовательных разрядов. Блокировка указывает на неспособность передачи NMJ вызвать ответ SFAP, и ее можно количественно оценить как наличие или отсутствие каждой пары SFAP во время добровольного SFEMG или для каждого NMJ во время стимулированного SFEMG 2,7.

Несмотря на то, что SFEMG является признанным и чувствительным тестом в клинических условиях, он лишь изредка применяется в доклинических исследованиях 4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . В этом отчете мы описываем подход к выполнению и анализу записей SFEMG на доклинических моделях грызунов. Кроме того, мы представляем репрезентативные данные, которые подчеркивают репрезентативные данные по SFEMG, указывающие на ухудшение передачи NMJ после введения недеполяризующего нервно-мышечного блокатора, рокурония.

протокол

Все протоколы были утверждены и выполнены в соответствии с правилами, установленными Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Миссури.

1. Подготовка животных и введение анестезии

  1. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты.
  2. Перед процедурой измерьте вес крысы, чтобы определить подходящую дозу для лекарств с учетом веса и настроек аппарата искусственной вентиляции легких.
  3. Вызвать анестезию с помощью 3%-5% ингаляционного изофлурана. Как только будет установлен адекватный уровень анестезии, поместите крысу в положение лежа и поддерживайте анестезию с помощью 1%-3% ингаляционного изофлурана.
  4. Проверьте адекватность глубины анестезии, аккуратно надавливая щипцами на подушечку задней конечности для наблюдения за отсутствием реакции отмены.
  5. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C.
  6. Наносите на глаза одобренную ветеринарами мазь на нефтяной основе, чтобы предотвратить сухость. Контролируйте глубину анестезии, наблюдая за частотой дыхания и оценивая реакцию отмены при надавливании на подушечку стопы с помощью щипцов.
  7. Побрейте оцениваемую заднюю конечность с помощью машинки для стрижки. После адекватного удаления волос с помощью клейкой ленты расположите исследуемую конечность так, чтобы лодыжка была зафиксирована под углом около 90° тыльного сгибания, колено было вытянуто, а бедро отведено.
  8. Непрерывно контролируйте дыхание и частоту сердечных сокращений крысы в течение всего эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение частоты сердечных сокращений обычно используется в качестве индикатора недостаточной глубины анестезии.
  9. Введите изофлуран для усыпления крысы в дозе 5% или более до тех пор, пока дыхание не прекратится по крайней мере на 3 минуты. Подтвердите эвтаназию обезглавливанием.

2. Установка и настройка электродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Передача NMJ седалищного нерва и икроножной мышцы оценивается с помощью системы электромиографии (ЭМГ). Обратитесь к Таблице материалов.

  1. Введите пару изолированных монополярных игл 28 G для стимуляции седалищного нерва с катодом в область проксимального отдела задней конечности, при этом анод находится более проксимально в пределах подкожной клетчатки, перекрывающей крестец.
  2. Убедитесь, что стимулирующие электроды не расположены в непосредственной близости от седалищного нерва или слишком глубоко, чтобы избежать прямого повреждения седалищного нерва или других прилегающих структур.
  3. Поместите одноразовый заземляющий электрод на контралатеральную заднюю конечность или хвост.
  4. Осторожно поместите игольчатый электрод 27 калибра 25 мм, специально предназначенный для одноволоконной ЭМГ, с записывающей поверхностью из платино-иридиевого материала, в правую икроножную мышцу. Перед каждым использованием электроды SFEMG должны быть автоклавированы для поддержания стерильности.
  5. Введите игольчатый электрод SFEMG параллельно волокнам икроножной мышцы, чтобы захватить потенциалы действия одного волокна (SFAP).
  6. Избегайте повреждения мышц при введении и маневрировании иглой SFEMG внутри мышцы.

3. Процедура вынужденной одноволоконной электромиографии (SFEMG)

  1. Применяйте стимуляцию постоянным током к правому седалищному нерву с частотой 10 Гц, используя диапазон интенсивности 0,3-10 мА и длительность импульса 0,1 мс.
  2. Настройте параметры фильтра в пределах низкочастотного фильтра 1 кГц и высокочастотного фильтра 10 кГц. Отрегулируйте коэффициент усиления в диапазоне от 200 мкВ до 1000 мкВ на деление для упрощения визуализации потенциалов. Установите скорость развертки на уровне 500 μс на деление.
  3. Отрегулируйте интенсивность стимула для запуска и изоляции SFAP для записи и последующего анализа.
    1. Чтобы идентифицировать и проанализировать отклик в качестве SFAP, убедитесь, что выполняются конкретные критерии, упомянутые ниже: убедитесь, что время нарастания от базового пика до отрицательной фазы составляет менее 500 μс, минимальная амплитуда (от исходного пика до отрицательного) составляет не менее 200 μВ, а отклик постоянно демонстрирует поведение «все или ничего» (стабильный размер и форма между откликами).
      Примечание: Важно, чтобы повторяющиеся реакции демонстрировали последовательные восходящие фазы без каких-либо зазубрин или точек перегиба. Обратите внимание, что последний критерий имеет решающее значение для отличия качественного сигнала от суммы нескольких сигналов.
  4. Рассчитайте джиттер, или вариабельность задержки SFAP (время между стимуляцией и фазой нарастания отрицательного пика SFAP) между последовательными разрядами после не менее 50 стимуляций (50–100 стимуляций), а также оцените и количественно оцените блокировку.
    Блокировка может быть оценена как наличие или отсутствие в каждом синапсе или как процент стимуляций, которые не запускают генерацию потенциала действия одного волокна. Джиттер рассчитывается с помощью следующего уравнения7 (Джиттер обычно автоматически рассчитывается клиническими электромиографическими системами):
    figure-protocol-5359
    MCD = Среднее значение последовательной разницы
    IPI = межпотенциальный интервал
  5. Повторите этот процесс для получения дополнительных ответов SFAP. В среднем оцените 10 синапсов от каждого животного, чтобы рассчитать джиттер и впоследствии определить средние значения на животное.
  6. Исключите из анализа SFAP с дрожанием менее 4 μс, чтобы предотвратить включение потенциалов, которые могли быть вызваны прямой стимуляцией мышц11.
  7. При регистрации потенциалов, демонстрирующих прерывистую блокировку, увеличьте интенсивность стимула, чтобы убедиться, что неудача SFAP не связана с субмаксимальной стимуляцией.

Результаты

Чтобы продемонстрировать повышенное джиттер и блокировку в контексте сбоя передачи NMJ, стимулированное SFEMG проводили с внутривенным введением рокурония и без него. Рокуроний является недеполяризующим нервно-мышечным блокатором промежуточного действия, широко испо?...

Обсуждение

SFEMG обычно используется для диагностического тестирования у пациентов с подозрением на аутоиммунные, приобретенные и генетические формы заболевания NMJ. SFEMG считается наиболее чувствительным тестом для диагностики расстройства NMJ, миастении20,21

Раскрытие информации

У. Дэвид Арнольд получал финансирование на исследования от NMD Pharma и Avidity Biosciences и консультирует NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics и Catalyst Pharmaceuticals.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Мартина Брандхёя Скова из NMD Pharma за его ценные советы по дозированию рокурония и Араша Карими из факультета биомедицинской инженерии Университета Стоуни-Брук за помощь в расчетах. Это исследование было частично поддержано финансированием со стороны NIH для WDA (R01AG067758 и R01AG078129).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
 27 G Reusable Single Fiber Needle ElectrodeTechnomed202860-000singlefiber recording electrode
2 mL Glass SyringeKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
Detachable CableTechnomed202845-0000to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leadsCadwell302290-000ground electrode
disposable monopolar needles 28 GTechnomed202270-000cathode and anode stimulating electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)Cadwell190266-200to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron baseRadio Shack64-079Maintaining recording electrode placement 
Isoflurane (250 mL bottle)Piramal HealthcareNA
monoject curved tip irrigating syringeCovidien81412012utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic WarmingKent Scientific CorporationPS-RTIncludes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming KitOster078577-010-003clippers for hair removal
Rat Endotracheal Tubes (16 G)Kent Scientific Corporation
Rocoronium BromideSigmaPHR2397-500MGneuromuscular blocker agent
Sierra Summit EMG systemCadwell Industries, Inc., Kennewick, WANAportable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSOMNOIncludes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment Puralube26870applied during anesthesia to avoid corneal injury

Ссылки

  1. Stalberg, E. Propagation velocity in human muscle fibers in situ. Acta Physiol Scand Suppl. 287, 1-112 (1966).
  2. Stålberg, E., Trontelj, J. V. The study of normal and abnormal neuromuscular transmission with single fibre electromyography. J Neurosci Methods. 74 (2), 145-154 (1997).
  3. Sanders, D. B., et al. Guidelines for single fiber EMG. Clin Neurophysiol. 130 (8), 1417-1439 (2019).
  4. Chugh, D., et al. Neuromuscular junction transmission failure is a late phenotype in aging mice. Neurobiol Aging. 86, 182-190 (2020).
  5. Padilla, C. J., et al. Profiling age-related muscle weakness and wasting: Neuromuscular junction transmission as a driver of age-related physical decline. GeroScience. 43 (3), 1265-1281 (2021).
  6. Selvan, V. A. Single-fiber EMG: A review. Ann Indian Acad Neurol. 14 (1), 64-67 (2011).
  7. Sanders, D. B., Kouyoumdjian, J. A., Stålberg, E. V. Single fiber electromyography and measuring jitter with concentric needle electrodes. Muscle Nerve. 66 (2), 118-130 (2022).
  8. Juel, V. C. Single fiber electromyography. Handb Clin Neurol. 160, 303-310 (2019).
  9. Chung, T., et al. Evidence for dying-back axonal degeneration in age-associated skeletal muscle decline. Muscle Nerve. 55 (6), 894-901 (2017).
  10. Iyer, C. C., et al. Follistatin-induced muscle hypertrophy in aged mice improves neuromuscular junction innervation and function. Neurobiol Aging. 104, 32-41 (2021).
  11. Meekins, G. D., Carter, G. T., Emery, M. J., Weiss, M. D. Axonal degeneration in the trembler-j mouse demonstrated by stimulated single-fiber electromyography. Muscle Nerve. 36 (1), 81-86 (2007).
  12. Gooch, C. L., Mosier, D. R. Stimulated single fiber electromyography in the mouse: Techniques and normative data. Muscle Nerve. 24 (7), 941-945 (2001).
  13. Chung, T., Tian, Y., Walston, J., Hoke, A. Increased single-fiber jitter level is associated with reduction in motor function with aging. Am J Phys Med Rehabil. 97 (8), 551-556 (2018).
  14. Sokolow, S., et al. Impaired neuromuscular transmission and skeletal muscle fiber necrosis in mice lacking na/ca exchanger 3. J Clin Investig. 113 (2), 265-273 (2004).
  15. Añor, S., et al. Evaluation of jitter by stimulated single-fiber electromyography in normal dogs. J Vet Intern Med. 17 (4), 545-550 (2003).
  16. Mizrachi, T., et al. NMO-IgG and AQP4 peptide can induce aggravation of eamg and immune-mediated muscle weakness. J Immunol Res. 2018, 5389282 (2018).
  17. Lin, T. S., Cheng, T. J. Stimulated single-fiber electromyography in the rat. Muscle Nerve. 21 (4), 482-489 (1998).
  18. Finley, D. B., Wang, X., Graff, J. E., Herr, D. W. Single fiber electromyographic jitter and detection of acute changes in neuromuscular function in young and adult rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 59 (2), 108-119 (2009).
  19. Khan, Z. H., Hajipour, A., Zebardast, J., Alomairi, S. R. Muscle relaxants in anesthesia practice: A narrative review. Arch Anesthesiol Crit Care. 4 (4), 547-552 (2018).
  20. Padua, L., Caliandro, P., Stålberg, E. A novel approach to the measurement of motor conduction velocity using a single fibre emg electrode. Clin Neurophysiol. 118 (9), 1985-1990 (2007).
  21. Khoo, A., Hay Mar, H., Borghi, M. V., Catania, S. Electrophysiologic evaluation of myasthenia gravis and its mimics: Real-world experience with single-fiber electromyography. Hosp Pract. 50 (5), 373-378 (2022).
  22. Nannan, G., et al. A role of lamin a/c in preventing neuromuscular junction decline in mice. J Neurosci. 40 (38), 7203 (2020).
  23. Alley, D. E., et al. Grip strength cutpoints for the identification of clinically relevant weakness. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 559-566 (2014).
  24. Juel, V. C. Clinical Neurophysiology of Neuromuscular Junction Disease. Handbook of Clinical Neurology. 161, 291-303 (2019).
  25. Rich, M. M. The control of neuromuscular transmission in health and disease. Neuroscientist. 12 (2), 134-142 (2006).
  26. Juel, V. C. Evaluation of neuromuscular junction disorders in the electromyography laboratory. Neurol Clin. 30 (2), 621-639 (2012).
  27. Arnold, W. D., Clark, B. C. Neuromuscular junction transmission failure in aging and sarcopenia: The nexus of the neurological and muscular systems. Ageing Res Rev. 89, 101966 (2023).
  28. Kokubun, N. Reference values for concentric needle single fiber EMG. Rinsho Shinkeigaku. 52 (11), 1246-1248 (2012).
  29. Testelmans, D., et al. Rocuronium exacerbates mechanical ventilation-induced diaphragm dysfunction in rats. Crit Care Med. 34 (12), 3018-3023 (2006).
  30. Suzuki, K., et al. Intravenous infusion of rocuronium bromide prolongs emergence from propofol anesthesia in rats. PLoS One. 16 (2), e0246858 (2021).
  31. Stålberg, E., et al. Reference values for jitter recorded by concentric needle electrodes in healthy controls: A multicenter study. Muscle Nerve. 53 (3), 351-362 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

SFEMGNMJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены