Elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori

Riepilogo

In questo studio, dimostriamo un raffinato protocollo di elettromiografia a fibra singola (SFEMG) per consentire la misurazione in vivo della trasmissione della giunzione neuromuscolare (NMJ) in modelli di roditori. Viene descritto un approccio graduale alla tecnica SFEMG per consentire la quantificazione della variabilità e del fallimento della trasmissione NMJ nel muscolo gastrocnemio di ratto.

Abstract

Come collegamento finale tra il sistema nervoso e il muscolo, la trasmissione alla giunzione neuromuscolare (NMJ) è fondamentale per la normale funzione motoria. L'elettromiografia a fibra singola (SFEMG) è una tecnica clinicamente rilevante e sensibile che misura le risposte al potenziale d'azione di una singola fibra muscolare durante le contrazioni volontarie o le stimolazioni nervose per valutare la trasmissione della NMJ. La valutazione e la quantificazione della trasmissione NMJ coinvolge due parametri: jitter e blocking. Il jitter si riferisce alla variabilità dei tempi (latenza) tra potenziali d'azione consecutivi a fibra singola (SFAP). Il blocco indica l'impossibilità della trasmissione NMJ di avviare una risposta SFAP. Sebbene la SFEMG sia un test ben consolidato e sensibile in ambito clinico, la sua applicazione nella ricerca preclinica è stata relativamente rara. Questo rapporto delinea i passaggi e i criteri impiegati nell'esecuzione di SFEMG stimolato per quantificare il jitter e il blocco nei modelli di roditori. Questa tecnica può essere utilizzata in studi preclinici e clinici per ottenere informazioni sulla funzione NMJ nel contesto della salute, dell'invecchiamento e della malattia.

Introduzione

L'elettromiografia a fibra singola (SFEMG) è stata inizialmente sviluppata da Stålberg ed Ekstedt negli anni '60 per identificare e analizzare i potenziali d'azione delle singole fibre muscolari, principalmente per studiare l'affaticamento muscolare¹. La SFEMG è la tecnica clinica più sensibile per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare (NMJ)². La SFEMG viene condotta registrando selettivamente i potenziali d'azione a fibra singola (SFAP)³. La trasmissione della NMJ può essere compromessa a causa di fattori come l'invecchiamento ^4,5 e vari disturbi neuromuscolari come la miastenia grave e la sclerosi laterale amiotrofica⁶. Inoltre, condizioni come l'ischemia, le fluttuazioni di temperatura e l'uso di agenti bloccanti neuromuscolari possono causare carenze nella trasmissione di NMJ, manifestate da un aumento della variabilità della trasmissione di NMJ e da occorrenze di fallimento di NMJ².

Esistono due approcci alla registrazione della SFEMG: SFEMG stimolata e volontaria. La SFEMG volontaria comporta la registrazione di SFAP da due NMJ forniti dallo stesso assone motore utilizzando un elettrodo ad ago concentrico inserito nel muscolo da testare durante l'attivazione volontaria⁷. Di conseguenza, la SFEMG volontaria richiede la collaborazione del soggetto e può valutare solo le unità motorie a bassa soglia (quelle attivate durante le contrazioni deboli)³. La SFEMG stimolata utilizza una coppia di elettrodi stimolanti per stimolare gli assoni motori durante la registrazione delle SFAP con un elettrodo ad ago SFEMG inserito nel muscolo da testare⁷.

Sia nella SFEMG volontaria che in quella stimolata, il jitter e il blocco sono i due parametri utilizzati per valutare e quantificare la trasmissione NMJ⁸. Il jitter descrive la variabilità della temporizzazione (latenza) tra SFAP consecutivi. Durante la SFEMG volontaria, il jitter viene quantificato valutando le differenze di latenza tra una coppia di SCAP (forniti dallo stesso assone motore) durante da 50 a 100 scariche consecutive. Durante la SFEMG stimolata, il jitter viene quantificato valutando le differenze di latenza tra i tempi di stimolazione e l'insorgenza della SFAP durante 50-100 scariche consecutive. Il blocco indica l'incapacità della trasmissione NMJ di innescare una risposta SFAP e può essere quantificato come la presenza o l'assenza di ciascuna coppia di SFAP durante SFEMG volontario o per ogni NMJ durante SFEMG^{stimolato 2,7}.

Sebbene sia un test consolidato e sensibile in ambito clinico, SFEMG è stato applicato solo raramente nella ricerca preclinica 4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . In questo rapporto, descriviamo l'approccio all'esecuzione e all'analisi delle registrazioni SFEMG in modelli preclinici di roditori. Inoltre, presentiamo dati rappresentativi che evidenziano risultati rappresentativi su SFEMG che indicano una compromissione della trasmissione NMJ in seguito alla somministrazione di un agente bloccante neuromuscolare non depolarizzante, il rocuronio.

Protocollo

Tutti i protocolli sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le normative stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Missouri.

1. Preparazione degli animali e somministrazione dell'anestesia

1. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
2. Prima della procedura, misurare il peso del ratto per determinare la dose appropriata per i farmaci basati sul peso e le impostazioni del ventilatore.
3. Indurre l'anestesia con isoflurano inalato al 3%-5%. Una volta stabilito un livello adeguato di anestesia, posizionare il ratto in posizione prona e mantenere l'anestesia con l'1%-3% di isoflurano inalato.
4. Verificare l'adeguatezza della profondità dell'anestesia premendo delicatamente il cuscinetto del piede dell'arto posteriore con una pinza per osservare l'assenza di una risposta di ritiro.
5. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
6. Applicare un unguento a base di petrolio approvato dal veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Monitora la profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria e valutando le risposte di astinenza quando applichi pressione al cuscinetto del piede usando una pinza.
7. Radere l'arto posteriore da valutare con un tagliacapelli. Dopo un'adeguata epilazione, utilizzando del nastro adesivo, posizionare l'arto da studiare con la caviglia fissata a circa 90° di dorsiflessione, il ginocchio in estensione e l'anca in abduzione.
8. Monitorare continuamente la respirazione e la frequenza cardiaca del ratto durante l'intero esperimento.
   NOTA: Un aumento della frequenza cardiaca è comunemente usato come indicatore di una profondità anestesiologica inadeguata.
9. Somministrare isoflurano per l'eutanasia del ratto, con una dose del 5% o superiore, fino a quando la respirazione non si è interrotta per almeno 3 minuti. Confermare l'eutanasia per decapitazione.

2. Posizionamento e configurazione dell'elettrodo

NOTA: La trasmissione NMJ del nervo sciatico e del muscolo gastrocnemio viene valutata utilizzando il sistema elettromiografico (EMG). Fare riferimento alla Tabella dei materiali.

1. Inserire un paio di aghi monopolari isolati da 28 G per stimolare il nervo sciatico con il catodo nella regione dell'arto posteriore prossimale, mentre l'anodo è più prossimalmente all'interno del tessuto sottocutaneo che si sovrappone all'osso sacro.
2. Assicurarsi che gli elettrodi stimolanti non siano posizionati nelle immediate vicinanze del nervo sciatico o eccessivamente profondi per evitare danni diretti al nervo sciatico o ad altre strutture adiacenti.
3. Posizionare un elettrodo di terra monouso sull'arto posteriore o sulla coda controlaterale.
4. Posizionare con cautela un elettrodo ad ago da 25 mm calibro 27 specificamente progettato per EMG a fibra singola, dotato di una superficie di registrazione in materiale platino-iridio nel muscolo gastrocnemio destro. Assicurarsi che gli elettrodi SFEMG siano sterilizzati in autoclave prima di ogni utilizzo per mantenere la sterilità.
5. Inserire l'elettrodo ad ago SFEMG in parallelo con le fibre muscolari del gastrocnemio per catturare i potenziali d'azione a fibra singola (SFAP).
6. Evitare danni muscolari durante l'inserimento e la manovra dell'ago SFEMG all'interno del muscolo.

3. Procedura di elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG)

1. Applicare una stimolazione a corrente costante al nervo sciatico destro a una frequenza di 10 Hz utilizzando un intervallo di intensità di 0,3-10 mA e una durata dell'impulso di 0,1 ms.
2. Configurare le impostazioni del filtro all'interno di un filtro a bassa frequenza di 1 kHz e di un filtro ad alta frequenza di 10 kHz. Regola il guadagno da 200 μV a 1000 μV per divisione per facilitare la visualizzazione dei potenziali. Impostare la velocità di scansione a 500 μs per divisione.
3. Regola l'intensità dello stimolo per attivare e isolare gli SFAP per la registrazione e la successiva analisi.
   1. Per identificare e analizzare una risposta come SFAP, assicurarsi che siano soddisfatti i criteri specifici indicati di seguito: assicurarsi che il tempo di salita dal picco di base alla fase negativa sia inferiore a 500 μs, che l'ampiezza minima (da picco basale a negativo) sia di almeno 200 μV e che la risposta mostri costantemente un comportamento tutto o niente (dimensioni e forma stabili tra le risposte).
      NOTA: È essenziale che le risposte ricorrenti mostrino fasi ascendenti coerenti senza tacche o punti di flesso. Si noti che l'ultimo criterio è fondamentale per distinguere un segnale di qualità dalla somma di più segnali.
4. Calcolare il jitter, o variabilità della latenza SFAP (tempo tra la stimolazione e la fase di salita del picco negativo di SFAP) tra scariche consecutive, a seguito di almeno 50 stimolazioni (50-100 stimolazioni), e valutare e quantificare il blocco.
   NOTA: Il blocco può essere valutato come la presenza o l'assenza in ciascuna sinapsi o come la percentuale di stimolazioni che non riescono a innescare la generazione di potenziali d'azione di una singola fibra. Il jitter viene calcolato utilizzando la seguente equazione⁷ (il jitter viene in genere calcolato automaticamente dai sistemi di elettromiografia clinica):
   
   MCD = Valore medio della differenza consecutiva
   IPI = Intervallo interpotenziale
5. Ripetere la procedura per ulteriori risposte SFAP. In media, valutare 10 sinapsi di ciascun animale per calcolare il jitter e successivamente determinare i valori medi per animale.
6. Escludere dalle analisi gli SFAP con jitter inferiore a 4 μs per evitare l'inclusione di potenziali che potrebbero essere stati evocati dalla stimolazione muscolare diretta¹¹.
7. Quando si registrano potenziali che mostrano un blocco intermittente, aumentare l'intensità dello stimolo per verificare che il fallimento della SFAP non sia attribuibile alla stimolazione submassimale.

Risultati

Per dimostrare un aumento del jitter e del blocco nel contesto del fallimento della trasmissione NMJ, la SFEMG stimolata è stata eseguita con e senza somministrazione endovenosa di rocuronio. Il rocuronio è un agente bloccante neuromuscolare ad azione intermedia e non depolarizzante, ampiamente utilizzato in ambito clinico per indurre la paralisi muscolare durante interventi chirurgici o procedure mediche. Funziona legandosi in modo competitivo ai recettori nicotinici dell'acetilcolina...

Discussione

SFEMG è comunemente usato per i test diagnostici in pazienti con sospette forme autoimmuni, acquisite e genetiche della malattia NMJ. SFEMG è considerato il test più sensibile per la diagnosi del disturbo NMJ, miastenia gravis^20,21. La stimolazione nervosa ripetitiva (RNS) è un altro metodo più comunemente utilizzato nei test diagnostici clinici e prevede la stimolazione di un nervo periferico con un treno di stimoli e la qu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G Reusable Single Fiber Needle Electrode	Technomed	202860-000	singlefiber recording electrode
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare	NA
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Rat Endotracheal Tubes (16 G)	Kent Scientific Corporation
Rocoronium Bromide	Sigma	PHR2397-500MG	neuromuscular blocker agent
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA	NA	portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury