מודל Alveolus-on-Chip חיסוני לחקר תגובות חיסוניות של נאדיות

Summary

מודלים של ריאות על שבב עולים על תרביות דו-ממדיות מסורתיות על ידי חיקוי ממשק אוויר-נוזל וזילוח תאי אנדותל, המדמים זרימת דם וחילופי חומרים מזינים החיוניים למחקרים בפיזיולוגיה של הריאות. זה משפר את הרלוונטיות של מחקר הריאות, ומציע סביבה דינמית ומדויקת פיזיולוגית לקידום ההבנה והטיפול בזיהומים בדרכי הנשימה.

Abstract

אנו מציגים מודל מתקדם של ריאות על שבב שנועד לשכפל את המבנה והתפקוד של הנאדיות האנושיות. מודל חדשני זה משתמש בשבב ביולוגי מחורר מיקרופלואידית התומך בממשק אוויר-נוזל המחקה את הסביבה בנאדיות האדם. הנדסת רקמות משמשת לשילוב רכיבי מפתח תאיים, כולל תאי אנדותל, מקרופאגים ותאי אפיתל, כדי ליצור מודל רקמתי מייצג של הנאדיות. המודל מאפשר בחינה מעמיקה של תגובות החיסון הרירית לפתוגנים שונים, כולל וירוסים, חיידקים ופטריות, ובכך מקדם את הבנתנו את חסינות הריאות. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק פרטים לביסוס מודל alveolus-on-chip זה כפלטפורמה חזקה במבחנה למחקרי זיהום, המאפשרת לחוקרים לעקוב מקרוב ולנתח את האינטראקציות המורכבות בין פתוגנים לבין מערכת החיסון של המארח בסביבת הריאות. זה מושג באמצעות יישום של טכניקות מבוססות מיקרופלואידים כדי לדמות מצבים פיזיולוגיים מרכזיים של נאדיות האדם, כולל זרימת דם וגירוי ביומכני של תאי אנדותל, לצד שמירה על ממשק אוויר-נוזל חיוני לחשיפה מציאותית של תאי אפיתל לאוויר. מערכת המודל תואמת למגוון בדיקות סטנדרטיות, כגון צביעת אימונופלואורסצנטיות, פרופיל ציטוקינים וניתוח יחידות יוצרות מושבה (CFU)/פלאק, ומאפשרת תובנות מקיפות על הדינמיקה החיסונית במהלך זיהום. Alveolus-on-chip מורכב מסוגי תאים חיוניים, כולל תאי אפיתל ריאה דיסטליים אנושיים (H441) ותאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) המופרדים על ידי קרומי פוליאתילן טרפתאלט נקבוביים (PET), עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים הממוקמים אסטרטגית בין שכבת האפיתל לשכבת האנדותל. מודל הרקמה משפר את היכולת לנתח ולנתח את הגורמים הניואנסיים המעורבים בתגובות חיסוניות ריאתיות במבחנה. ככלי רב ערך, הוא אמור לתרום לקידום מחקר הריאות, לספק מודל מבחנה מדויק ודינמי יותר לחקר הפתוגנזה של זיהומים בדרכי הנשימה ולבדיקת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

לריאה האנושית יש תפקיד יוצא דופן בנשימה ובהגנה החיסונית, עם אינטראקציות מורכבות בין התגובות החיסוניות של רירית הנאדית¹. היכולת של הנאדיות ליצור תגובה חיסונית יעילה חיונית למניעת דלקות ריאה ולהבטחת בריאות הריאות. מכיוון שהריאות חשופות כל הזמן למגוון רחב של סיכונים פוטנציאליים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות, אלרגיות וחומר חלקיקי, הבנת המורכבות של תגובות החיסון של רירית הנאדיות היא קריטית לגילוי המנגנונים מאחורי זיהומים בדרכי הנשימה, הפרעות דלקתיות וטיפול במחלות ריאה¹.

כדי לחקור זיהומים ותהליכים הקשורים לדלקת של דרכי הנשימה במבחנה, נדרשים מודלים שיכולים לחקות נאמנה את הסביבה הנאדית ואת התגובות החיסוניות. תרביות תאים דו-ממדיות ומודולים של בעלי חיים שימשו במשך עשרות שנים ככלים חיוניים למחקר ביו-רפואי על תגובה חיסונית ריאתית. עם זאת, לעתים קרובות יש להם מגבלות בפוטנציאל התרגום שלהם למצבים אנושיים. מודלים של ריאות על שבב יכולים לתרום למילוי הפער בין מודלים מסורתיים במבחנה ו-in vivo ולספק גישה חדשנית לחקר תגובות חיסוניות ספציפיות לבני אדם ^2,3. מודלים של ריאות על שבב יכולים לחקות את ממשק האוויר-נוזל, הנדרש לתאי הריאה כדי לשחזר מצבים פיזיולוגיים של דרכי הנשימה ולפתח מודל רקמות מדויק וחזק יותר. טכניקת תרבית זו מאפשרת בחינה מדויקת של התמיינות תאים, תפקודם ותגובות לתרופות או גירויים הקשורים למחלות במבחנה².

במחקר זה, אנו מציגים מודל מבוסס מיקרופלואידים של הנאדיות האנושיות ככלי יעיל לשחזור הסביבה הנאדית האנושית על ידי הפעלת זילוח כדי לחקות זרימת דם וגירוי ביומכני של תאי אנדותל ושילוב ממשק אוויר-נוזל עם תאי אפיתל שנחשפו לקראת שלב^{אוויר 4}. פיתחנו נאדיות על שבב מיקרופלואידיות המחקות את המבנה הפיזי ואת האינטראקציות הביולוגיות של הנאדיות האנושיות, עם דגש מיוחד על ממשק אוויר-נוזל. ממשק זה ממלא תפקיד מכריע בהתמיינות תאי אפיתל נשימתיים, החיוניים למידול מדויק של הסביבה הריאתית. המודל משתמש בתאי אפיתל ריאה דיסטליים אנושיים (H441) ובתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs), המופרדים על ידי קרומי פוליאתילן טרפתאלט נקבוביים (PET), עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים הממוקמים בין שכבות התא. מערך זה משכפל את הסידור התאי המורכב של הנאדיות והוא קריטי להדמיה מדויקת של ממשק אוויר-נוזל, המהווה גורם משמעותי בתפקוד הפיזיולוגי של רקמת הריאה.

הרציונל מאחורי פיתוח המודל משתרע על שילוב הן של תאים חיסוניים במחזור הדם והן של תאי חיסון השוכנים ברקמות. גישה זו נועדה לחקות במדויק את תגובת המאכסן הדלקתי לזיהומים בדרכי הנשימה בבני אדם, ולספק סביבה דינמית לחקר אינטראקציות פתוגן-מארח. נוכחותם של מקרופאגים מאפשרת לבחון תגובות חיסוניות מיידיות ואת האינטראקציה שלהן עם פתוגנים, המשקפת את קו ההגנה הראשון מפני זיהומים בדרכי הנשימה. יתר על כן, העיצוב של פלטפורמת השבב הביולוגי מאפשר מניפולציה נוחה ומדויקת של רמזים ביופיזיים וביוכימיים כאחד, שהיא חיונית לשכפול תפקוד הנאדיות במבחנה. גמישות זו חיונית בניתוח הגורמים התורמים לזיהומים אנושיים, ומאפשרת לחוקרים להתאים את התנאים כך שישקפו מצבי מחלה שונים או לבחון התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. התאימות של הפלטפורמה עם טכנולוגיות קריאה מרובות, כולל מיקרוסקופיה מתקדמת, ניתוחים מיקרוביולוגיים וניתוח שפכים ביוכימיים, משפרת את התועלת שלה. יכולות אלה מאפשרות הערכה מקיפה של תגובת הרקמה לזיהומים, כולל הערכת התנהגות תאית, התפשטות פתוגנים ויעילות של תגובות חיסוניות.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט וטכניקות ליצירה ושימוש במודל נאדיות על שבב אנושי המתמקד בשכפול ממשק אוויר-נוזל ושילוב תאי חיסון לחקר זיהומים אנושיים במבחנה.

Protocol

תאי HUVEC מבודדים מחבל הטבור ומשמשים עד מעבר 4. מונוציטים ראשוניים מבודדים מתורמים בריאים מדם שלם. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי יינה, יינה, גרמניה (3939-12/13). על פי הצהרת הלסינקי, כל האנשים שתרמו תאים למחקר נתנו את הסכמתם מדעת.

1. יום 1: הכנת השבב הביולוגי

1. השבבים הביולוגיים זמינים בגדלים ובדגמים שונים. לניסויים כאן, השתמש במודל BC002. הניחו את הביו-שבב בצלחת פטרי מזכוכית, מלאו את הצלחת ושטפו את כל החללים באתנול סטרילי 70% (EthOH). יש לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לשטוף את החללים 2x עם ddH_{סטרילי 2}O. הסירו את ddH₂O.
2. צפו את קרום השבב הביולוגי של שני החללים בתמיסת קולגן IV סטרילית (0.5 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.5 מילימול; השתמשו בריכוז של 1:100 במי מלח חוצצים פוספט של דולבקו המכיל מגנזיום וסידן PBS (+/+)) על ידי שטיפה עדינה של תמיסת קולגן IV דרך שני החללים באמצעות פיפט של 1,000 מיקרוליטר עם קצוות כחולים. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   הערה: מומלץ להשתמש בצינור של 1,000 μL עם קצוות מסנן כחול (P1000) לאורך כל הפרוטוקול. קוטר הפתיחה של קצה המסנן מכסה לחלוטין את פתח היציאות המחברות בין הערוצים, מה שמונע הכנסת בועות אוויר לשבב.
3. לאחר 30 דקות דגירה, יש לשטוף את החדר התחתון והעליון 2x עם PBS סטרילי (+/+) כדי לשטוף החוצה את שאריות הקולגן והחומצה האצטית.
4. הכן מדיום EC על ידי הוספת 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL). מלא את החדר העליון של כל חלל עם 250 μL של מדיום EC ואת החדר התחתון עם 150 μL של מדיום EC.
5. קציר HUVEC מבקבוק T25 משולב: יש לשטוף עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco ללא PBS מגנזיום וסידן (-/-), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין + 1 mM EDTA ב- PBS (-/-) ולדגור במשך 3 דקות ב 37 ° C. עצור את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל PBS (+/+) + 5% FCS וצנטריפוגה ב 350 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) בצינור חרוטי 50 מ"ל. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של מדיום EC.
6. השתמש בדילול טורי ביחס של 1:10 בעת ביצוע ספירת תאים. הוסף 10 μL של גלולת התא המרחף ל 90 μL של תווך התא. שלבו את הדגימות בזהירות. השתמש צינור microcentrifuge עם 10 μL של כתם כחול trypan. דלל את תמיסת התא בכחול טריפאן (1:1) באמצעות שקופיות תא ספירת תאים. ספור את התאים באופן ידני עם תא נויבאואר או עם מונה תאים אוטומטי. קבע את ספירת התאים והתאם את הריכוז ל- 0.4 x 10⁶ תאים לכל 200 μL.
7. החלף את תווך תאי האנדותל בחדר העליון של השבב הביולוגי עם 200 μL של תווך EC המכיל HUVECs מרחפים. פיפטה בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בתעלות או תאים. הניחו את צלחת הפטרי מזכוכית עם הביו-צ'יפס בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO_2.

2. יום 2: בדיקת שכבת התא

1. ביום השני, בדוק חזותית את המפגש של שכבת התא HUVEC בחדר העליון. בצע חילוף בינוני בחדר העליון עם 300 μL של מדיום EC. פיפטה בעדינות כדי למנוע ניתוק של תאים מן הממברנה. בצע חילופי מדיה מדי יום לאחר 24 שעות. הניחו את צלחת הפטרי מזכוכית עם הביו-צ'יפס בחזרה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.

3. יום 3: הכנת החדר התחתון

1. בדוק חזותית את המפגש של שכבת תאי האנדותל. בנקודה זו, קבעו את נוכחותם של שכבה קונפלואנטית ומורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת (איור 1). בצע חילוף בינוני בחדר העליון עם 300 μL של מדיום EC.
2. לאחר מכן, להכין את החדר התחתון עבור זריעת התאים המרכיבים את שכבת אפיתל. יש לשטוף את החדר התחתון בעדינות עם 150 μL של מדיום RPMI (להוסיף 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 5% נסיוב פרה עוברית, 1 מיקרומטר dexamethasone).
3. עבור החדר התחתון, זרע 0.5 x 10⁶ H441 תאים מרחפים ב 200 μL של RPMI בינוני (RPMI) לכל חלל.
4. קצירת תאי H441
   1. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS (-/-) פעם אחת. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין + 1 mM EDTA ב- PBS (-/-).
   2. לדגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C ו 5% CO₂. זמן הדגירה משתנה בהתאם למפגש של השכבה. תוך 5-7 דקות, התאים אמורים להתנתק לחלוטין.
   3. עצור את פעילות הטריפסין עם 10 מ"ל PBS (+/+) + 5% FBS, אסוף את התאים והצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 4 דקות.
   4. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של RPMI, ולספור.
   5. זרעו 0.5 x 10⁶ תאים לכל תא על ידי פיפטציה עדינה של תמיסת התא לתוך החדר התחתון. סגור את כל היציאות והפוך את השבב הביולוגי כך שהתאים יוכלו להתחבר לקרום ה-PET. שמור את השבב הביולוגי הפוך ודגור למשך הלילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.

4. ימים 4 - יום7: תחזוקת תאים וקצירת מונוציטים

1. בצע חילוף בינוני יומי בחדר העליון והתחתון. עבור החדר העליון, לבצע את חילופי בינוני עם 300 μL של מדיום EC.
2. יש להשתמש ב-200 μL של RPMI+ (RPMI בינוני בתוספת 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% סרום אנושי אוטולוגי, 1 μM dexamethasone) עבור החדר התחתון. ביום 7, שטפו את החדר התחתון עם RPMI+ כדי להכין את החלל לזריעת מונוציטים.
3. זרעים 0.1 x 10⁶ מונוציטים מרחפים ב 200 μL RPMI+ בתא התחתון.
4. קצירת מונוציטים
   1. יש לשטוף את התאים עם 1 מ"ל PBS (-/-) ולדגור במשך 7 דקות ב-37°C ב-PBS שחומם מראש (-/-) המכיל 4 מ"ג/מ"ל לידוקאין + 5 mM EDTA ב-37°C ו-5% CO₂.
   2. אסוף את התאים והצנטריפוגה במהירות של 350 x גרם למשך 7 דקות, השעה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של RPMI+ וספור. הניחו את יציאות השבב הפונות כלפי מטה כך שהתאים יתחברו לממברנה.

5. יום 8: זילוח ביו-שבב

1. בשלב זה, ודא שהשבבים הביולוגיים מוכנים לחיבור לזרימה ומחוררים. לפני תחילת הזלוף, להכין אינקובטור ריק ומניחים את המשאבה פריסטלטית בפנים.
2. זילוח של biochips
   1. לפני חיבור הצינורית המעוקרת לביו-שבב, שטפו את הצינורית עם 200 μL של PBS (+/+), ואחריו 200 μL של מדיום EC. לצינור קוטר פנימי של 0.5 מ"מ, המורכב מדפנות ארוכות יותר (20 ס"מ) וקצרות יותר (12 ס"מ) המחולקות על ידי שני פקקי משאבה פריסטלטיים. מניחים את הצינור בצד ומכינים את המאגרים למדיום.
   2. בצע חילוף בינוני בחדרים העליונים והתחתונים על ידי שטיפתם עם מדיום תרבית התאים הטרי שהוכן בהתאמה.
   3. הכניסו את המאגר בצד היציאה של השבב הביולוגי וחברו את המאגר עם הצינור לכניסת השבב הביולוגי (איור 2). חברו את הצינור למאגר ולביו-שבב כך שיהיה זילוח תווך מעגלי בין המאגר לביו-שבב.
   4. ברגע שהכל מחובר לנמלים, מלא את המאגר עם 500 μL של מדיום EC. חברו את השבב הביולוגי עם הצינורית על זילוח עם קצב זרימה של 21 מיקרוליטר/דקה (איור 2). התבונן מקרוב במהלך 15 הדקות הראשונות של זילוח להחדרת בועות. יש לבצע החלפה בינונית מדי יום בשני החדרים.

6. יום 9 - יום 11: הקמת ממשק אוויר-נוזל

1. עוצרים את הזלוף, מרוקנים את המאגרים וממלאים מחדש במצע טרי שהוכן תחת ארון בטיחות סטרילי. פיפטה 500 μL של EC בינוני לתוך המאגרים ולשטוף בעדינות את התא התחתון עם 200 μL של RPMI+. התחילו שוב את הזילוח עם קצב זילוח של 21 מיקרוליטר/דקה.
2. ממשק נוזלי אוויר (ALI)
   1. להקים ALI מהיום ה-12 ועד סוף הניסוי (יום 14). במהלך תרבית ALI יש לחשוף את תאי האפיתל לאוויר.
   2. כדי לבסס את תרבית ALI, הכינו EC חדש של מדיום כלי הדם (הוסף 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 10 ng/ml GM-CSF, 20% סרום אנושי אוטולוגי, 1μM dexamethasone) כדי לשמור על כל סוגי התאים בשבב. בשלב זה, המדיום מכיל ריכוז גבוה יותר של AS (20%).
   3. פתחו את התקעים בתא התחתון מתחת לארון בטיחות סטרילי וספגו בזהירות את המדיום עד להופעת בועת אוויר, כפי שמוצג באיור 3. ודא שכל הנוזל מהתעלה ומהחדר הוסר וסגור את היציאות בזהירות.
   4. מלאו את המאגרים במדיום EC (-/-) והמשיכו בתרבית זילוח בקצב זרימה של 21 מיקרוליטר/דקה. החליפו בינוני רק בחדר העליון עד היום ה-14 ושמרו את תאי האפיתל בחדר התחתון עם אוויר בלבד.

7. יום 14: קצירת רקמות ואנליזתן

1. נתק את השבב הביולוגי מהזרימה. חבר את הצינורית ובדוק במיקרוסקופ אם יש מפגש תאים. בשל האוויר בחדר התחתון, שכבות התא עשויות להיראות מטושטשות וקשות לדמיין. בשלב זה, המודל מוכן לניסויים נוספים.
2. קיבוע והכתמה של רקמה בביו-שבב
   1. שטפו את החללים עם PBS (+/+) כדי להסיר את מדיום תרבית התא. פיפטה 300 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) מומסת ב-PBS (-/-) לחדר העליון ו-200 μL בחדר התחתון ודוגרת במשך 10 דקות ב-RT.
      הערה: בעת עבודה עם כימיקלים לקיבוע כגון PFA, השתמש במכסה אדים. אספו והשליכו את הפסולת בהתאם.
   2. שטפו את התאים 3x עם PBS (+/+). לאחר הקיבוע, לאחסן את biochips ב 4 °C או להשתמש בהם ישירות עבור צביעת immunofluorescence של תאים.
   3. עבור חדירה, פיפטה 300 μL של 0.25% Triton X-100 ב PBS (+/+). דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
   4. לאחר הדגירה, יש לשטוף את שני התאים עם PBS (+/+) ופיפטה 300 μL של אלבומין סרום בקר 3% (BSA) ב-PBS (+/+) בשני החדרים. דגירה במשך שעה אחת ב- RT.
   5. בינתיים, להכין את לוח נוגדנים עבור צביעת immunofluorescence. כדי להכין את פאנל הנוגדנים לצביעת אימונופלואורסנציה, הוקמה צינורית עם כמות מספקת של 3% BSA כדי לדלל את הנוגדנים. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים עבור כל ממברנה. השתמש ביחס דילול של 1:100 עבור לוחות נוגדנים ראשוניים ו- 1:200 עבור לוחות נוגדנים משניים. בנוסף, עבור פאנל הנוגדנים המשני, הכינו DAPI ביחס דילול של 1:2,000. לגבי נוגדנים מתאימים, ראו (טבלה 1).
   6. כדי לגשת ישירות לתאים בתוך השבב, יש להסיר את רדיד המליטה. כדי לפתוח את התאים microfluidic, לבצע חתך מדויק על פני החלק החיצוני של החלל ולהסיר את נייר המליטה. חותכים את הממברנה החוצה על ידי הסרת הקצוות האטומים לשבב הביולוגי עם האזמל.
      הערה: עבוד בצורה מדויקת ומדויקת במהלך שלב זה כדי למנוע נזק לממברנה ופציעות עקב חדות האזמל.
   7. לאחר ניתוק הממברנה מהשבב, מחלקים את הממברנה לשני חלקים. אספו את חתיכות הממברנה בעזרת פינצטה והניחו אותן על שקופית מיקרוסקופית לצביעה.
   8. פיפטה 50 μL של תמיסת נוגדנים לכל חתיכת ממברנה. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (75 °F), מוגן מפני אור.
   9. לאחר הדגירה, מניחים את הממברנה ב 500 μL של PBS (-/-) בצלחת 24 באר ולשטוף את הממברנה 3x במשך 5 דקות כל אחד PBS (+/+). לאחר שטיפה, פיפטה 50 μL של תמיסת נוגדנים משנית לדגור במשך 1 שעה ב RT מוגן מפני אור.
   10. שטפו את הממברנה עם PBS (+/+) 3x למשך 5 דקות כל אחד. בינתיים, הכינו ותייגו את השקופיות המיקרוסקופיות לניסוי. מניחים טיפה של אמצעי הרכבה על השקופית ומניחים את הממברנה המתאימה. חזור על שלב זה עבור כל הממברנות. בסוף, מניחים טיפה אחת נוספת של אמצעי ההרכבה על החלק העליון של הממברנה ומשתמשים בזכוכית כיסוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.

תוצאות

בדיקה של שינויים מורפולוגיים וביטוי חלבוני סמן יכולה להתבצע באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. לאחר תרבית משותפת במשך 14 יום, צד כלי הדם וצד האפיתל מנותחים לביטוי של סמני תאים בהתאמה. שיטה זו שימושית לחקר האינטראקציות והשלמות של מרכיבי כלי הדם והאפיתל, החיוניים למידול מחלות כקריאה ביולוגי...

Discussion

מודל הנאדיות על השבב מייצג מודל רקמה רב-שכבתי של הנאדיות האנושיות, המשלב סוגי תאים חיוניים של דרכי הנשימה התחתונות, כולל תאי אפיתל ריאה, תאי אנדותל ומקרופאגים, בתרבית בסידור אורגנוטיפי ב-ALI עם זילוח בינוני של רירית האנדותל. תאים משכבות שונות מבטאים חלבוני סמן תאים ספציפיים כגון E-cadherin, מולק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss