S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats Représentatifs
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les modèles de poumons sur puce surpassent les cultures 2D traditionnelles en imitant l’interface air-liquide et la perfusion de cellules endothéliales, simulant le flux sanguin et l’échange de nutriments essentiels pour les études de physiologie pulmonaire. Cela renforce la pertinence de la recherche pulmonaire, en offrant un environnement dynamique et physiologiquement précis pour faire progresser la compréhension et le traitement des infections respiratoires.

Résumé

Nous présentons un modèle avancé de poumon sur puce immunocompétent conçu pour reproduire la structure et la fonction alvéolaires humaines. Ce modèle innovant utilise une biopuce perfusée microfluidique qui prend en charge une interface air-liquide imitant l’environnement dans les alvéoles humaines. L’ingénierie tissulaire est utilisée pour intégrer des composants cellulaires clés, notamment des cellules endothéliales, des macrophages et des cellules épithéliales, afin de créer un modèle tissulaire représentatif de l’alvéole. Le modèle facilite l’examen approfondi des réponses immunitaires de la muqueuse à divers agents pathogènes, notamment les virus, les bactéries et les champignons, faisant ainsi progresser notre compréhension de l’immunité pulmonaire. L’objectif principal de ce protocole est de fournir des détails pour établir ce modèle d’alvéole sur puce en tant que plate-forme in vitro robuste pour les études d’infection, permettant aux chercheurs d’observer et d’analyser de près les interactions complexes entre les agents pathogènes et le système immunitaire de l’hôte dans l’environnement pulmonaire. Ceci est réalisé grâce à l’application de techniques basées sur la microfluidique pour simuler les conditions physiologiques clés des alvéoles humaines, y compris le flux sanguin et la stimulation biomécanique des cellules endothéliales, tout en maintenant une interface air-liquide cruciale pour l’exposition réaliste des cellules épithéliales à l’air. Le système de modèle est compatible avec une gamme de tests standardisés, tels que la coloration par immunofluorescence, le profilage des cytokines et l’analyse des unités formant des colonies (UFC)/plaques, ce qui permet d’obtenir des informations complètes sur la dynamique immunitaire pendant l’infection. L’alvéole sur puce est composée de types de cellules essentiels, y compris les cellules épithéliales pulmonaires distales humaines (H441) et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) séparées par des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des macrophages primaires dérivés de monocytes stratégiquement positionnés entre les couches épithéliales et endothéliales. Le modèle tissulaire améliore la capacité de disséquer et d’analyser les facteurs nuancés impliqués dans les réponses immunitaires pulmonaires in vitro. En tant qu’outil précieux, il devrait contribuer à l’avancement de la recherche sur les maladies pulmonaires, en fournissant un modèle in vitro plus précis et plus dynamique pour étudier la pathogenèse des infections respiratoires et tester des interventions thérapeutiques potentielles.

Introduction

Le poumon humain joue un rôle remarquable dans la respiration et la défense immunitaire, avec des interactions complexes entre les réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire1. La capacité des alvéoles à créer une réponse immunitaire efficace est essentielle pour prévenir les infections pulmonaires et assurer la santé pulmonaire. Étant donné que les poumons sont constamment exposés à un large éventail de risques potentiels, notamment les bactéries, les virus, les champignons, les allergies et les particules, il est essentiel de comprendre les complexités des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire pour découvrir les mécanismes à l’o....

Protocole

Les cellules HUVEC sont isolées des cordons ombilicaux et utilisées jusqu’au passage 4. Les monocytes primaires sont isolés à partir de donneurs sains à partir de sang total. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Iéna, Iéna, Allemagne (3939-12/13). Selon la Déclaration d’Helsinki, toutes les personnes qui ont donné des cellules pour l’étude ont donné leur consentement éclairé.

1. Jour 1 : Préparation de la biopuce

  1. Les biopuces sont disponibles en différentes tailles et modèles. Pour les expériences ici, utilisez le modèle BC002. Placez la biopuce dans une boîte de Pétri en ve....

Résultats Représentatifs

Un examen des altérations morphologiques et de l’expression des protéines marqueurs pourrait être effectué à l’aide de la coloration par immunofluorescence. Après une co-culture de 14 jours, les côtés vasculaire et épithélial sont analysés pour l’expression des marqueurs cellulaires respectifs. Cette méthode est utile pour étudier les interactions et l’intégrité des composants vasculaires et épithéliaux, ce qui est essentiel pour la modélisation de la maladie en tant que lecture biologique fonct.......

Discussion

Le modèle d’alvéole sur puce représente un modèle tissulaire multicouche de l’alvéole humaine, intégrant les types de cellules essentielles des voies respiratoires inférieures, y compris les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules endothéliales et les macrophages, cultivés dans un arrangement organotypique à un ALI avec une perfusion moyenne de la muqueuse endothéliale. Les cellules de différentes couches expriment des protéines marqueurs cellulaires spécifiques telles que la E-cadhérine, une.......

Déclarations de divulgation

K.R. est PDG de Dynamic42 GmbH et détient des actions de l’entreprise. A.S.M. est conseiller scientifique de Dynamic 42 GmbH et détient des actions de l’entreprise. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

H.K. et A.S.M. reconnaissent le financement du Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, financé par la ligne de financement Strategic Networking de l’Association Leibniz. M.A. et A.S.M. ont été soutenus par le projet IGF IMPROVE financé par le ministère fédéral de l’Économie et de l’Énergie sur la base d’une résolution du Bundestag allemand. A.S.M remercie en outre le soutien financier du Cluster of Excellence Balance of the Microverse dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.

....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)InvitrogenC10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592
Eco wipesDr. Schuhmacher00-915-REW10003-01
Eppies 2.0Sarstedt72.691
Eppis 0.5Sarstedt72.699
Eppis 1.5Sarstedt72.690.001
Falcons 15mLGreiner Bio-One188 271-TRI
Falcons 50mLGreiner Bio-One227 261-TRI
Gauze swabNobaPZN 2417767
Gloves Nitril 3000Meditrade1280
Microscope slidesMenzel-GläserAAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mmAssistent40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mmAssistent40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)Falcon352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mmSarstedt85.1637.235
ScalpelsDahlhausen11.000.00.715
Serological pipettes 10mLGreiner Bio-One607 160-TRI
Serological pipettes 25mLGreiner Bio-One760 160-TRI
Serological pipettes 2mLGreiner Bio-One710 160-TRI
Serological pipettes 50mLGreiner Bio-One768 160-TRI
Serological pipettes 5mLGreiner Bio-One606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-GelSarstedt1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3ESarstedt02.1066.001
Softasept NBraun3887138
T25 flaskGreiner Bio-One690 960
Tips sterile 10µLGreiner Bio-One771 261
Tips sterile 1250µLGreiner Bio-One750 261
Tips sterile 300µLGreiner Bio-One738 261
Tips unsterile 10µLGreiner Bio-One765 290
Tips unsterile 1000µLGreiner Bio-One739 291
Tips unsterile 200µLGreiner Bio-One686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1
Chemicals
Descosept AFDr. SchuhmacherN-20338
Ethanol 96%Nordbrand-Nordhausen410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)Sigma AldrichFD4-100MG
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
MethanolVWR20847.295
SaponinFluka47036
TergazymeAlconox1304-1
Cell culture
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG
DexametasonSigma-AldrichD4902
DPBS (-/-)LonzaBE17-516F
DPBS (+/+)LonzaBE17-513F
EDTA solutionSigma-AldrichE788S
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225
Fetal bovine SerumSigma-AldrichE2129-10g
H441ATCC
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30
LidocainSigma-AldrichL5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122 /-163
RPMIGibco72400047
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282
TrypsinGibco15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)BD610252
CD68 (rabbit)CellSignaling76437
E-Cadherin (goat)R&DAF748
SP-A (mouse)Abcamab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)InvitrogenR37114
AF647 (donkey anti mouse)invitrogenA31571
AF647 (donkey anti rabbit)InvitrogenA31573
Cy3 (donkey anti goat)jackson research705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
Microfluidic
ChipDynamic 42BC002
Male Luer Lock (small)ChipShop09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, greenMicrofluidic chipshop09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, redMicrofluidic chipshop09-0557-0336-10
PlugsCole ParmerGZ-45555-56
Reservoir 4.5mLChipShop16-0613-0233-09
TubingDynamic 42ST001
Equipment
AutoclaveTuttnauer5075 ELV
CentrifugeEppendorf5424
CO2 IncubatorHeracell150i
Countess automated cell counterInvitrogenC10227
FlowcytometerBDFACS Canto II
Freezer (-20 °C)LiebherrLCexv 4010
Freezer (-80 °C)HeraeusHerafreeze HFU 686
FridgeLiebherrLCexv 4010
Heraeus MultifugeThermo ScientificX3R
MicroscopeLeicaDM IL LED
Orbital shakerHeidolphReax2000
Peristaltic pumpREGLO Digital MS-4/12ISM597D
Pipettes 10µLEppendorf Research plus3123000020
Pipettes 100µLEppendorf Research plus3123000047
Pipettes 1000µLEppendorf Research plus3123000063
Pipettes 2.5µLEppendorf Research plus3123000012
Pipettes 20µLEppendorf Research plus3123000039
Pipettes 200µLEppendorf Research plus3123000055
ScaleSartorius6101
ScaleSartoriusTE1245
Sterile benchKojairBiowizard SL-130
WaterbathJulaboSW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2Zeiss
Illumination deviceZeissHXP 120 C
MicroscopeZeissAxio Observer 5
Optical SectioningZeissApoTome
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232
Software
ZEN Blue EditionZeiss

Références

  1. Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
  2. Artzy-Schnirman, A., et al.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Mots cl s Alv ole sur puceImmunocomp tentPoumon sur puceR ponses immunitaires de la muqueuse alv olaireMicrofluidiqueInterface air liquideIng nierie tissulaireCellules endoth lialesMacrophagesCellules pith lialesAgents pathog nesImmunit pulmonaireMod le d infection in vitroConditions physiologiquesProfilage des cytokinesAnalyse d unit s formant coloniesCellules H441HUVECMacrophages primaires d riv s de monocytesInfections respiratoiresInterventions th rapeutiques

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Recherche

Enseignement

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.