Modèle d’alvéole sur puce immunocompétent pour l’étude des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire

Résumé

Les modèles de poumons sur puce surpassent les cultures 2D traditionnelles en imitant l’interface air-liquide et la perfusion de cellules endothéliales, simulant le flux sanguin et l’échange de nutriments essentiels pour les études de physiologie pulmonaire. Cela renforce la pertinence de la recherche pulmonaire, en offrant un environnement dynamique et physiologiquement précis pour faire progresser la compréhension et le traitement des infections respiratoires.

Résumé

Nous présentons un modèle avancé de poumon sur puce immunocompétent conçu pour reproduire la structure et la fonction alvéolaires humaines. Ce modèle innovant utilise une biopuce perfusée microfluidique qui prend en charge une interface air-liquide imitant l’environnement dans les alvéoles humaines. L’ingénierie tissulaire est utilisée pour intégrer des composants cellulaires clés, notamment des cellules endothéliales, des macrophages et des cellules épithéliales, afin de créer un modèle tissulaire représentatif de l’alvéole. Le modèle facilite l’examen approfondi des réponses immunitaires de la muqueuse à divers agents pathogènes, notamment les virus, les bactéries et les champignons, faisant ainsi progresser notre compréhension de l’immunité pulmonaire. L’objectif principal de ce protocole est de fournir des détails pour établir ce modèle d’alvéole sur puce en tant que plate-forme in vitro robuste pour les études d’infection, permettant aux chercheurs d’observer et d’analyser de près les interactions complexes entre les agents pathogènes et le système immunitaire de l’hôte dans l’environnement pulmonaire. Ceci est réalisé grâce à l’application de techniques basées sur la microfluidique pour simuler les conditions physiologiques clés des alvéoles humaines, y compris le flux sanguin et la stimulation biomécanique des cellules endothéliales, tout en maintenant une interface air-liquide cruciale pour l’exposition réaliste des cellules épithéliales à l’air. Le système de modèle est compatible avec une gamme de tests standardisés, tels que la coloration par immunofluorescence, le profilage des cytokines et l’analyse des unités formant des colonies (UFC)/plaques, ce qui permet d’obtenir des informations complètes sur la dynamique immunitaire pendant l’infection. L’alvéole sur puce est composée de types de cellules essentiels, y compris les cellules épithéliales pulmonaires distales humaines (H441) et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) séparées par des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des macrophages primaires dérivés de monocytes stratégiquement positionnés entre les couches épithéliales et endothéliales. Le modèle tissulaire améliore la capacité de disséquer et d’analyser les facteurs nuancés impliqués dans les réponses immunitaires pulmonaires in vitro. En tant qu’outil précieux, il devrait contribuer à l’avancement de la recherche sur les maladies pulmonaires, en fournissant un modèle in vitro plus précis et plus dynamique pour étudier la pathogenèse des infections respiratoires et tester des interventions thérapeutiques potentielles.

Introduction

Le poumon humain joue un rôle remarquable dans la respiration et la défense immunitaire, avec des interactions complexes entre les réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire¹. La capacité des alvéoles à créer une réponse immunitaire efficace est essentielle pour prévenir les infections pulmonaires et assurer la santé pulmonaire. Étant donné que les poumons sont constamment exposés à un large éventail de risques potentiels, notamment les bactéries, les virus, les champignons, les allergies et les particules, il est essentiel de comprendre les complexités des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire pour découvrir les mécanismes à l’origine des infections respiratoires, des troubles inflammatoires et du traitement des maladies pulmonaires¹.

Pour étudier in vitro les processus liés à l’infection et à l’inflammation des voies respiratoires, il est nécessaire d’utiliser des modèles capables d’imiter fidèlement le milieu alvéolaire et les réponses immunitaires. La culture cellulaire 2D et les modules animaux sont utilisés depuis des décennies comme outils essentiels pour la recherche biomédicale sur la réponse immunitaire pulmonaire. Cependant, ils ont souvent des limites dans leur potentiel de traduction dans des situations humaines. Les modèles de poumons sur puce peuvent contribuer à combler le vide entre les modèles in vitro et in vivo traditionnels et fournir une nouvelle approche pour étudier les réponses immunitaires spécifiques à l’homme ^2,3. Les modèles de poumons sur puce peuvent imiter l’interface air-liquide, qui est nécessaire aux cellules pulmonaires pour récapituler les conditions physiologiques des voies respiratoires et développer un modèle tissulaire plus précis et plus robuste. Cette technique de culture permet d’examiner avec précision la différenciation cellulaire, le fonctionnement et les réponses aux médicaments ou aux stimuli liés à la maladie in vitro².

Dans cette étude, nous présentons un modèle microfluidique de l’alvéole humaine comme outil efficace pour récapituler le milieu alvéolaire humain en appliquant une perfusion pour imiter le flux sanguin et une stimulation biomécanique des cellules endothéliales et en incorporant une interface air-liquide avec des cellules épithéliales exposées vers une phase⁴ de l’air. Nous avons développé une alvéole microfluidique perfusée sur puce qui imite la structure physique et les interactions biologiques de l’alvéole humaine, en mettant l’accent sur l’interface air-liquide. Cette interface joue un rôle crucial dans la différenciation des cellules épithéliales respiratoires, ce qui est essentiel pour modéliser avec précision l’environnement pulmonaire. Le modèle utilise des cellules épithéliales pulmonaires distales humaines (H441) et des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), séparées par des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des macrophages primaires dérivés de monocytes positionnés entre les couches cellulaires. Cette configuration reproduit l’arrangement cellulaire complexe de l’alvéole et est essentielle pour simuler avec précision l’interface air-liquide, qui est un facteur important dans la fonction physiologique du tissu pulmonaire.

La raison d’être du développement du modèle s’étend à l’intégration des cellules immunitaires circulantes et tissulaires. Cette approche est conçue pour imiter avec précision la réponse inflammatoire de l’hôte aux infections respiratoires humaines, fournissant un environnement dynamique pour étudier les interactions pathogène-hôte. La présence de macrophages permet d’examiner les réponses immunitaires immédiates et leur interaction avec les agents pathogènes, reflétant la première ligne de défense contre les infections respiratoires. De plus, la conception de la plate-forme de biopuce facilite la manipulation pratique et précise des signaux biophysiques et biochimiques, ce qui est crucial pour reproduire la fonction de l’alvéole in vitro. Cette flexibilité est essentielle pour disséquer les facteurs contribuant aux infections humaines, ce qui permet aux chercheurs d’ajuster les conditions pour refléter divers états pathologiques ou de tester des interventions thérapeutiques potentielles. La compatibilité de la plate-forme avec de multiples technologies de lecture, notamment la microscopie avancée, les analyses microbiologiques et l’analyse des effluents biochimiques, renforce son utilité. Ces capacités permettent une évaluation complète de la réponse tissulaire aux infections, y compris l’évaluation du comportement cellulaire, de la prolifération des agents pathogènes et de l’efficacité des réponses immunitaires.

Nous présentons un protocole et des techniques détaillés pour créer et utiliser un modèle d’alvéole humaine sur puce axé sur la réplication de l’interface air-liquide et l’intégration de cellules immunitaires pour étudier les infections humaines in vitro.

Protocole

Les cellules HUVEC sont isolées des cordons ombilicaux et utilisées jusqu’au passage 4. Les monocytes primaires sont isolés à partir de donneurs sains à partir de sang total. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Iéna, Iéna, Allemagne (3939-12/13). Selon la Déclaration d’Helsinki, toutes les personnes qui ont donné des cellules pour l’étude ont donné leur consentement éclairé.

1. Jour 1 : Préparation de la biopuce

1. Les biopuces sont disponibles en différentes tailles et modèles. Pour les expériences ici, utilisez le modèle BC002. Placez la biopuce dans une boîte de Pétri en verre, remplissez la boîte et rincez toutes les cavités avec de l’éthanol stérile à 70 % (EthOH). Incuber pendant 45 min à température ambiante. Ensuite, rincez les cavités 2x avec du ddH₂O stérile. Retirez le ddH₂O.
2. Enduire la membrane de la biopuce des deux cavités avec une solution de collagène IV stérile (0,5 mg/mL dans 0,5 mM d’acide acétique ; utiliser une concentration de 1:100 dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco contenant du magnésium et du calcium PBS (+/+)) en rinçant doucement la solution de collagène IV à travers les deux cavités à l’aide d’une pipette de 1 000 μL avec des pointes bleues. Incuber pendant 15 min à 37 °C et 5% de CO₂.
   REMARQUE : L’utilisation d’une pipette de 1 000 μL avec des pointes de filtre bleu (P1000) est recommandée tout au long du protocole. Le diamètre de l’ouverture de l’embout du filtre recouvre entièrement l’ouverture des orifices reliant les canaux, ce qui évite l’insertion de bulles d’air dans la puce.
3. Après 30 minutes d’incubation, rincez les chambres inférieure et supérieure 2 fois avec du PBS stérile (+/+) pour éliminer le collagène et l’acide acétique restants.
4. Préparez le milieu EC en ajoutant 1:100 (v/v) de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL). Remplissez la chambre supérieure de chaque cavité avec 250 μL de fluide EC et la chambre inférieure avec 150 μL de milieu EC.
5. Récoltez HUVEC dans une fiole T25 confluente : Laver avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans PBS de magnésium et de calcium (-/-), ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % + 1 mM d’EDTA dans du PBS (-/-) et incuber pendant 3 min à 37 °C. Arrêter l’activité de la trypsine en ajoutant 5 mL de PBS (+/+) + 5 % de FCS et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) dans un tube conique de 50 mL. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu EC.
6. Utilisez une dilution en série de 1:10 lors du comptage cellulaire. Ajouter 10 μL de pastille cellulaire remise en suspension à 90 μL de milieu cellulaire. Combinez soigneusement les échantillons. Utilisez un tube de microcentrifugation avec 10 μL de colorant bleu trypan. Diluer la solution cellulaire avec du bleu de trypan (1:1) à l’aide de lames de chambre de comptage de cellules. Comptez les cellules soit manuellement à l’aide d’une chambre Neubauer, soit à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Déterminer le nombre de cellules et ajuster la concentration à 0,4 x 10⁶ cellules par 200 μL.
7. Remplacer le milieu de cellules endothéliales dans la chambre supérieure de la biopuce par 200 μL de milieu EC contenant des HUVEC en suspension. Pipeter doucement pour éviter la formation de bulles d’air dans les canaux ou les chambres. Placez la boîte de Pétri en verre avec les biopuces à 37 °C et 5% de CO_2.

2. Jour 2 : Vérification de la couche cellulaire

1. Le jour 2, vérifiez visuellement la confluence de la couche cellulaire HUVEC dans la chambre supérieure. Effectuez un échange de fluide dans la chambre supérieure avec 300 μL de fluide EC. Pipeter doucement pour éviter le détachement des cellules de la membrane. Effectuez un échange de médias tous les jours après 24h. Remettez la boîte de Pétri en verre avec les biopuces à 37 °C et 5 % de CO₂.

3. Jour 3 : Préparation de la chambre basse

1. Vérifiez visuellement la confluence de la couche de cellules endothéliales. À ce stade, déterminez la présence d’une couche confluente et d’une morphologie semblable à celle des galets (Figure 1). Effectuez un échange de fluide dans la chambre supérieure avec 300 μL de fluide EC.
2. Ensuite, préparez la chambre inférieure pour l’ensemencement des cellules formant la couche épithéliale. Rincer doucement la chambre inférieure avec 150 μL de milieu RPMI (ajouter 1:100 (v/v) de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL), 5 % de sérum de vache fœtale, 1 μM de dexaméthasone).
3. Pour la chambre inférieure, ensemencer 0,5 x 10⁶ cellules H441 en suspension dans 200 μL de milieu RPMI (RPMI) par cavité.
4. Récolte des cellules H441
   1. Lavez les cellules avec 5 mL de PBS (-/-) une fois. Ajouter 2 mL de trypsine à 0,25 % + 1 mM d’EDTA dans du PBS (-/-).
   2. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C et 5% de CO₂. Le temps d’incubation varie en fonction de la confluence de la pondeuse. En 5 à 7 minutes, les cellules devraient se détacher complètement.
   3. Arrêtez l’activité de la trypsine avec 10 mL de PBS (+/+) + 5 % de FBS, collectez les cellules et centrifugez à 200 x g pendant 4 min.
   4. Après la centrifugation, jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de RPMI et compter.
   5. Ensemencez 0,5 x 10⁶ cellules par chambre en pipetant doucement la solution cellulaire dans la chambre inférieure. Fermez tous les ports et retournez la biopuce pour que les cellules puissent se fixer à la membrane PET. Gardez la biopuce à l’envers et incubez toute la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.

4. Jours 4 - Jour 7 : Entretien des cellules et récolte des monocytes

1. Effectuez quotidiennement l’échange de fluide dans les chambres supérieure et inférieure. Pour la chambre supérieure, effectuez l’échange de fluide avec 300 μL de fluide EC.
2. Utilisez 200 μL de RPMI+ (milieu RPMI plus 1:100 (v/v) pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL), 10 ng/mL DE GM-CSF, 10 % de sérum humain autologue, 1 μM de dexaméthasone) pour la chambre inférieure. Le jour 7, rincez la chambre inférieure avec du RPMI+ pour préparer la cavité pour l’ensemencement des monocytes.
3. Graine 0,1 x 10⁶ monocytes en suspension dans 200 μL RPMI+ dans la chambre inférieure.
4. Récolte des monocytes
   1. Laver les cellules avec 1 mL de PBS (-/-) et incuber pendant 7 min à 37 °C dans du PBS préchauffé (-/-) contenant 4 mg/mL de lidocaïne + 5 mM d’EDTA à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Récupérez les cellules et centrifugez-les à 350 x g pendant 7 min, remettez-les en suspension dans 1 ml de RPMI+ et comptez. Placez les ports de la biopuce vers le bas pour que les cellules se fixent à la membrane.

5. Jour 8 : Perfusion de biopuce

1. À ce stade, assurez-vous que les biopuces sont prêtes à être connectées au flux et perfusées. Avant de commencer la perfusion, préparez un incubateur vide et placez la pompe péristaltique à l’intérieur.
2. Perfusion des biopuces
   1. Avant de fixer la tubulure stérilisée à la biopuce, rincez la tubulure avec 200 μL de PBS (+/+), suivie de 200 μL de milieu EC. Le tube a un diamètre intérieur de 0,5 mm, composé de côtés plus longs (20 cm) et plus courts (12 cm) divisés par deux bouchons de pompe péristaltiques. Mettez le tube de côté et préparez les réservoirs pour le fluide.
   2. Effectuez le remplacement du milieu dans les chambres supérieure et inférieure en les rinçant avec le milieu de culture cellulaire fraîchement préparé correspondant.
   3. Insérez le réservoir du côté de la sortie de la biopuce et connectez le réservoir avec la tubulure à l’entrée de la biopuce (Figure 2). Connectez le tube au réservoir et à la biopuce de manière à ce qu’il y ait une perfusion circulaire entre le réservoir et la biopuce.
   4. Une fois que tout est connecté aux ports, remplissez le réservoir avec 500 μL de fluide EC. Connectez la biopuce à la tubulure sur une perfusion avec un débit de 21 μL/min (Figure 2). Observez attentivement pendant les 15 premières minutes de perfusion l’insertion des bulles. Effectuez quotidiennement un échange de fluide dans les deux chambres.

6. Jour 9 - Jour 11 : Établissement d’une interface air-liquide

1. Arrêtez la perfusion, videz les réservoirs et remplissez-les de milieu fraîchement préparé sous une enceinte de sécurité stérile. Pipetez 500 μL de fluide EC dans les réservoirs et rincez doucement la chambre inférieure avec 200 μL de RPMI+. Recommencer la perfusion avec un débit de perfusion de 21 μL/min.
2. Interface air-liquide (ALI)
   1. Établissez l’ALI du 12e jour jusqu’à la fin de l’expérience (14e jour). Pendant la culture ALI, exposez les cellules épithéliales à l’air.
   2. Pour établir la culture ALI, préparez un nouveau milieu vasculaire EC (ajouter 1:100 (v/v) Pénicilline/Streptomycine (10 000 U/mL), 10 ng/ml de GM-CSF, 20 % de sérum humain autologue, 1 μM de dexaméthasone) pour maintenir tous les types de cellules dans la puce. À ce stade, le milieu contient une concentration plus élevée de SA (20%).
   3. Ouvrez les bouchons de la chambre inférieure sous une enceinte de sécurité stérile et imprégnez-le soigneusement jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit visible, comme le montre la figure 3. Assurez-vous que tout le liquide du canal et de la chambre est retiré et fermez soigneusement les orifices.
   4. Remplissez les réservoirs avec un milieu EC (-/-) et poursuivez la culture par perfusion avec un débit de 21 μL/min. Changez le milieu uniquement au niveau de la chambre supérieure jusqu’au 14e jour et conservez les cellules épithéliales dans la chambre inférieure avec de l’air uniquement.

7. Jour 14 : Prélèvement et analyse des tissus

1. Déconnectez la biopuce du flux. Branchez la tubulure et vérifiez au microscope la confluence cellulaire. En raison de l’air dans la chambre inférieure, les couches cellulaires peuvent sembler floues et difficiles à visualiser. À ce stade, le modèle est prêt pour d’autres expérimentations.
2. Fixation et coloration de tissus dans une biopuce
   1. Lavez les cavités avec du PBS (+/+) pour retirer le milieu de culture cellulaire. Pipeter 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dissous dans du PBS (-/-) dans la chambre supérieure et 200 μL dans la chambre inférieure et incuber pendant 10 min à RT.
      REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des produits chimiques de fixation tels que le PFA, utilisez une hotte. Collectez et éliminez les déchets en conséquence.
   2. Lavez les chambres 3 fois avec du PBS (+/+). Après la fixation, stockez les biopuces à 4 °C ou utilisez-les directement pour la coloration par immunofluorescence des cellules.
   3. Pour la perméabilisation, pipette 300 μL de Triton X-100 à 0,25 % dans du PBS (+/+). Incuber pendant 30 min à RT.
   4. Après l’incubation, laver les deux chambres avec du PBS (+/+) et pipeter 300 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans du PBS (+/+) dans les deux chambres. Incuber pendant 1 h à RT.
   5. Pendant ce temps, préparez le panel d’anticorps pour la coloration par immunofluorescence. Pour préparer le panel d’anticorps à la coloration par immunofluorescence, un tube contenant une quantité suffisante de BSA à 3 % a été mis en place pour diluer les anticorps. Utilisez 50 μL de dilutions d’anticorps pour chaque membrane. Utilisez un rapport de dilution de 1:100 pour les panels d’anticorps primaires et de 1:200 pour les panels d’anticorps secondaires. De plus, pour le panel d’anticorps secondaires, préparez le DAPI à un rapport de dilution de 1:2 000. Pour les anticorps correspondants, voir (Tableau 1).
   6. Pour accéder directement aux cellules de la biopuce, la feuille de liaison doit être retirée. Pour ouvrir les chambres microfluidiques, faites une coupe précise à l’extérieur de la cavité et retirez la feuille de liaison. Découpez la membrane en retirant les bords scellés à la biopuce avec le scalpel.
      REMARQUE : Travaillez avec précision et précision au cours de cette étape pour éviter tout dommage à la membrane et les blessures dues à la netteté du scalpel.
   7. Après avoir détaché la membrane de la biopuce, divisez la membrane en deux morceaux. Prélevez les morceaux de membrane à l’aide d’une pince à épiler et placez-les sur une lame microscopique pour les colorer.
   8. Pipette de 50 μL de solution d’anticorps par morceau de membrane. Incuber une nuit à 4 °C, à l’abri de la lumière.
   9. Après l’incubation, placez la membrane dans 500 μL de PBS (-/-) dans une plaque à 24 puits et lavez la membrane 3x pendant 5 min chacune dans du PBS (+/+). Après le lavage, pipeter 50 μL de solution secondaire d’anticorps et incuber pendant 1 h à RT à l’abri de la lumière.
   10. Lavez la membrane avec du PBS (+/+) 3 fois pendant 5 min chacune. Pendant ce temps, préparez et étiquetez les lames microscopiques pour l’expérience. Placez une goutte de support de montage sur la glissière et placez la membrane correspondante. Répétez cette étape pour toutes les membranes. À la fin, placez une goutte supplémentaire du support de montage sur le dessus de la membrane et utilisez un verre de protection. Conserver à 4 °C.

Résultats

Un examen des altérations morphologiques et de l’expression des protéines marqueurs pourrait être effectué à l’aide de la coloration par immunofluorescence. Après une co-culture de 14 jours, les côtés vasculaire et épithélial sont analysés pour l’expression des marqueurs cellulaires respectifs. Cette méthode est utile pour étudier les interactions et l’intégrité des composants vasculaires et épithéliaux, ce qui est essentiel pour la modélisation de la maladie en tant que lecture biologique fonct...

Discussion

Le modèle d’alvéole sur puce représente un modèle tissulaire multicouche de l’alvéole humaine, intégrant les types de cellules essentielles des voies respiratoires inférieures, y compris les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules endothéliales et les macrophages, cultivés dans un arrangement organotypique à un ALI avec une perfusion moyenne de la muqueuse endothéliale. Les cellules de différentes couches expriment des protéines marqueurs cellulaires spécifiques telles que la E-cadhérine, une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss