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Les modèles de poumons sur puce surpassent les cultures 2D traditionnelles en imitant l’interface air-liquide et la perfusion de cellules endothéliales, simulant le flux sanguin et l’échange de nutriments essentiels pour les études de physiologie pulmonaire. Cela renforce la pertinence de la recherche pulmonaire, en offrant un environnement dynamique et physiologiquement précis pour faire progresser la compréhension et le traitement des infections respiratoires.
Nous présentons un modèle avancé de poumon sur puce immunocompétent conçu pour reproduire la structure et la fonction alvéolaires humaines. Ce modèle innovant utilise une biopuce perfusée microfluidique qui prend en charge une interface air-liquide imitant l’environnement dans les alvéoles humaines. L’ingénierie tissulaire est utilisée pour intégrer des composants cellulaires clés, notamment des cellules endothéliales, des macrophages et des cellules épithéliales, afin de créer un modèle tissulaire représentatif de l’alvéole. Le modèle facilite l’examen approfondi des réponses immunitaires de la muqueuse à divers agents pathogènes, notamment les virus, les bactéries et les champignons, faisant ainsi progresser notre compréhension de l’immunité pulmonaire. L’objectif principal de ce protocole est de fournir des détails pour établir ce modèle d’alvéole sur puce en tant que plate-forme in vitro robuste pour les études d’infection, permettant aux chercheurs d’observer et d’analyser de près les interactions complexes entre les agents pathogènes et le système immunitaire de l’hôte dans l’environnement pulmonaire. Ceci est réalisé grâce à l’application de techniques basées sur la microfluidique pour simuler les conditions physiologiques clés des alvéoles humaines, y compris le flux sanguin et la stimulation biomécanique des cellules endothéliales, tout en maintenant une interface air-liquide cruciale pour l’exposition réaliste des cellules épithéliales à l’air. Le système de modèle est compatible avec une gamme de tests standardisés, tels que la coloration par immunofluorescence, le profilage des cytokines et l’analyse des unités formant des colonies (UFC)/plaques, ce qui permet d’obtenir des informations complètes sur la dynamique immunitaire pendant l’infection. L’alvéole sur puce est composée de types de cellules essentiels, y compris les cellules épithéliales pulmonaires distales humaines (H441) et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) séparées par des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des macrophages primaires dérivés de monocytes stratégiquement positionnés entre les couches épithéliales et endothéliales. Le modèle tissulaire améliore la capacité de disséquer et d’analyser les facteurs nuancés impliqués dans les réponses immunitaires pulmonaires in vitro. En tant qu’outil précieux, il devrait contribuer à l’avancement de la recherche sur les maladies pulmonaires, en fournissant un modèle in vitro plus précis et plus dynamique pour étudier la pathogenèse des infections respiratoires et tester des interventions thérapeutiques potentielles.
Le poumon humain joue un rôle remarquable dans la respiration et la défense immunitaire, avec des interactions complexes entre les réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire1. La capacité des alvéoles à créer une réponse immunitaire efficace est essentielle pour prévenir les infections pulmonaires et assurer la santé pulmonaire. Étant donné que les poumons sont constamment exposés à un large éventail de risques potentiels, notamment les bactéries, les virus, les champignons, les allergies et les particules, il est essentiel de comprendre les complexités des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire pour découvrir les mécanismes à l’o....
Les cellules HUVEC sont isolées des cordons ombilicaux et utilisées jusqu’au passage 4. Les monocytes primaires sont isolés à partir de donneurs sains à partir de sang total. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Iéna, Iéna, Allemagne (3939-12/13). Selon la Déclaration d’Helsinki, toutes les personnes qui ont donné des cellules pour l’étude ont donné leur consentement éclairé.
1. Jour 1 : Préparation de la biopuce
Un examen des altérations morphologiques et de l’expression des protéines marqueurs pourrait être effectué à l’aide de la coloration par immunofluorescence. Après une co-culture de 14 jours, les côtés vasculaire et épithélial sont analysés pour l’expression des marqueurs cellulaires respectifs. Cette méthode est utile pour étudier les interactions et l’intégrité des composants vasculaires et épithéliaux, ce qui est essentiel pour la modélisation de la maladie en tant que lecture biologique fonct.......
Le modèle d’alvéole sur puce représente un modèle tissulaire multicouche de l’alvéole humaine, intégrant les types de cellules essentielles des voies respiratoires inférieures, y compris les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules endothéliales et les macrophages, cultivés dans un arrangement organotypique à un ALI avec une perfusion moyenne de la muqueuse endothéliale. Les cellules de différentes couches expriment des protéines marqueurs cellulaires spécifiques telles que la E-cadhérine, une.......
K.R. est PDG de Dynamic42 GmbH et détient des actions de l’entreprise. A.S.M. est conseiller scientifique de Dynamic 42 GmbH et détient des actions de l’entreprise. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
H.K. et A.S.M. reconnaissent le financement du Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, financé par la ligne de financement Strategic Networking de l’Association Leibniz. M.A. et A.S.M. ont été soutenus par le projet IGF IMPROVE financé par le ministère fédéral de l’Économie et de l’Énergie sur la base d’une résolution du Bundestag allemand. A.S.M remercie en outre le soutien financier du Cluster of Excellence Balance of the Microverse dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
Coverslips (24x40mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | |
Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
Gauze swab | Noba | PZN 2417767 | |
Gloves Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
Microscope slides | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E | |
Multiwell Plates 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | |
Pasteur pipettes (glass) 150mm | Assistent | 40567001 | |
Pasteur pipettes (glass) 230mm | Assistent | 40567002 | |
Round-bottom tubes (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
Serological pipettes 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
Serological pipettes 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
Serological pipettes 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
Serological pipettes 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
Softasept N | Braun | 3887138 | |
T25 flask | Greiner Bio-One | 690 960 | |
Tips sterile 10µL | Greiner Bio-One | 771 261 | |
Tips sterile 1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 | |
Tips sterile 300µL | Greiner Bio-One | 738 261 | |
Tips unsterile 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 | |
Tips unsterile 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 | |
Tips unsterile 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 | |
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
Chemicals | |||
Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Methanol | VWR | 20847.295 | |
Saponin | Fluka | 47036 | |
Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
Cell culture | |||
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
EDTA solution | Sigma-Aldrich | E788S | |
Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | |
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | |
Fetal bovine Serum | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
H441 | ATCC | ||
Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
RPMI | Gibco | 72400047 | |
Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
Primary antibodies | |||
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat) | BD | 610252 | |
CD68 (rabbit) | CellSignaling | 76437 | |
E-Cadherin (goat) | R&D | AF748 | |
SP-A (mouse) | Abcam | ab51891 | |
Secondary antibodies | |||
AF488 (donkey anti mouse) | Invitrogen | R37114 | |
AF647 (donkey anti mouse) | invitrogen | A31571 | |
AF647 (donkey anti rabbit) | Invitrogen | A31573 | |
Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
Microfluidic | |||
Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
Male mini luer plugs, row of four,PP, green | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 | |
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | |
Male mini luer plugs, row of four,PP, red | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 | |
Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
Reservoir 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
Tubing | Dynamic 42 | ST001 | |
Equipment | |||
Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
CO2 Incubator | Heracell | 150i | |
Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | |
Flowcytometer | BD | FACS Canto II | |
Freezer (-20 °C) | Liebherr | LCexv 4010 | |
Freezer (-80 °C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
Fridge | Liebherr | LCexv 4010 | |
Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
Microscope | Leica | DM IL LED | |
Orbital shaker | Heidolph | Reax2000 | |
Peristaltic pump | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
Pipettes 10µL | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
Pipettes 100µL | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
Pipettes 1000µL | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
Pipettes 2.5µL | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
Pipettes 20µL | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
Pipettes 200µL | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
Scale | Sartorius | 6101 | |
Scale | Sartorius | TE1245 | |
Sterile bench | Kojair | Biowizard SL-130 | |
Waterbath | Julabo | SW-20C | |
Fluorescence Microscope Setup | |||
Apotome.2 | Zeiss | ||
Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | |
Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | |
Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | |
Software | |||
ZEN Blue Edition | Zeiss |
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