Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar

Resumo

Os modelos de pulmão em chip superam as culturas 2D tradicionais, imitando a interface ar-líquido e a perfusão de células endoteliais, simulando o fluxo sanguíneo e a troca de nutrientes cruciais para estudos de fisiologia pulmonar. Isso aumenta a relevância da pesquisa pulmonar, oferecendo um ambiente dinâmico e fisiologicamente preciso para avançar na compreensão e no tratamento de infecções respiratórias.

Resumo

Apresentamos um modelo avançado de pulmão em chip imunocompetente projetado para replicar a estrutura e função alveolar humana. Este modelo inovador emprega um biochip perfundido microfluídico que suporta uma interface ar-líquido que imita o ambiente nos alvéolos humanos. A engenharia de tecidos é usada para integrar os principais componentes celulares, incluindo células endoteliais, macrófagos e células epiteliais, para criar um modelo de tecido representativo do alvéolo. O modelo facilita exames aprofundados das respostas imunes da mucosa a vários patógenos, incluindo vírus, bactérias e fungos, avançando assim nossa compreensão da imunidade pulmonar. O objetivo principal deste protocolo é fornecer detalhes para estabelecer este modelo de alvéolo em chip como uma plataforma in vitro robusta para estudos de infecção, permitindo que os pesquisadores observem e analisem de perto as complexas interações entre patógenos e o sistema imunológico do hospedeiro no ambiente pulmonar. Isso é alcançado por meio da aplicação de técnicas baseadas em microfluídica para simular as principais condições fisiológicas dos alvéolos humanos, incluindo fluxo sanguíneo e estimulação biomecânica das células endoteliais, além de manter uma interface ar-líquido crucial para a exposição realista das células epiteliais ao ar. O sistema modelo é compatível com uma variedade de ensaios padronizados, como coloração por imunofluorescência, perfil de citocinas e análise de unidade formadora de colônias (UFC)/placa, permitindo insights abrangentes sobre a dinâmica imunológica durante a infecção. O Alveolus-on-chip é composto por tipos de células essenciais, incluindo células epiteliais pulmonares distais humanas (H441) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), com macrófagos primários derivados de monócitos estrategicamente posicionados entre as camadas epitelial e endotelial. O modelo de tecido aumenta a capacidade de dissecar e analisar os fatores diferenciados envolvidos nas respostas imunes pulmonares in vitro. Como uma ferramenta valiosa, deve contribuir para o avanço da pesquisa pulmonar, fornecendo um modelo in vitro mais preciso e dinâmico para estudar a patogênese das infecções respiratórias e testar possíveis intervenções terapêuticas.

Introdução

O pulmão humano tem um papel marcante na respiração e na defesa imunológica, com interações complexas entre as respostas imunes da mucosa alveolar¹. A capacidade dos alvéolos de criar uma resposta imune eficiente é vital para prevenir infecções pulmonares e garantir a saúde pulmonar. Como os pulmões estão constantemente expostos a uma ampla gama de riscos potenciais, incluindo bactérias, vírus, fungos, alergias e material particulado, entender as complexidades das respostas imunes da mucosa alveolar é fundamental para descobrir os mecanismos por trás de infecções respiratórias, distúrbios inflamatórios e tratamento de doenças pulmonares¹.

Para estudar os processos relacionados à infecção e inflamação do trato respiratório in vitro, são necessários modelos que possam imitar fielmente o meio alveolar e as respostas imunes. A cultura de células 2D e os módulos animais têm sido usados há décadas como ferramentas essenciais para a pesquisa biomédica sobre a resposta imune pulmonar. No entanto, muitas vezes eles têm limitações em seu potencial de tradução para situações humanas. Os modelos lung-on-chip podem contribuir para preencher a lacuna entre os modelos tradicionais in vitro e in vivo e fornecer uma nova abordagem para estudar as respostas imunes específicas do ser humano ^2,3. Os modelos de pulmão em chip podem imitar a interface ar-líquido, que é necessária para que as células pulmonares recapitulem as condições fisiológicas do trato respiratório e desenvolvam um modelo de tecido mais preciso e robusto. Essa técnica de cultura permite um exame preciso da diferenciação, funcionamento e respostas celulares a drogas ou estímulos relacionados a doenças in vitro².

Neste estudo, apresentamos um modelo baseado em microfluídica do alvéolo humano como uma ferramenta eficaz para recapitular o meio alveolar humano, aplicando perfusão para imitar o fluxo sanguíneo e a estimulação biomecânica das células endoteliais e incorporando uma interface ar-líquido com células epiteliais expostas a uma fase aérea⁴. Desenvolvemos um alvéolo perfundido microfluídico em chip que imita a estrutura física e as interações biológicas do alvéolo humano, com foco particular na interface ar-líquido. Essa interface desempenha um papel crucial na diferenciação das células epiteliais respiratórias, o que é essencial para modelar com precisão o ambiente pulmonar. O modelo usa células epiteliais pulmonares distais humanas (H441) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), com macrófagos primários derivados de monócitos posicionados entre as camadas celulares. Essa configuração replica o intrincado arranjo celular do alvéolo e é fundamental para simular com precisão a interface ar-líquido, que é um fator significativo na função fisiológica do tecido pulmonar.

A lógica por trás do desenvolvimento do modelo se estende à integração de células imunes circulantes e residentes no tecido. Essa abordagem foi projetada para imitar com precisão a resposta inflamatória do hospedeiro a infecções respiratórias humanas, fornecendo um ambiente dinâmico para estudar as interações patógeno-hospedeiro. A presença de macrófagos permite o exame das respostas imunes imediatas e sua interação com patógenos, refletindo a primeira linha de defesa contra infecções respiratórias. Além disso, o design da plataforma do biochip facilita a manipulação conveniente e precisa de pistas biofísicas e bioquímicas, o que é crucial para replicar a função do alvéolo in vitro. Essa flexibilidade é fundamental para dissecar os fatores que contribuem para infecções humanas, permitindo que os pesquisadores ajustem as condições para refletir vários estados de doença ou testem possíveis intervenções terapêuticas. A compatibilidade da plataforma com várias tecnologias de leitura, incluindo microscopia avançada, análises microbiológicas e análise bioquímica de efluentes, aumenta sua utilidade. Esses recursos permitem uma avaliação abrangente da resposta tecidual a infecções, incluindo a avaliação do comportamento celular, proliferação de patógenos e a eficácia das respostas imunes.

Apresentamos um protocolo detalhado e técnicas para criar e utilizar um modelo de alvéolo humano em chip focado na replicação da interface ar-líquido e na integração de células imunes para estudar infecções humanas in vitro.

Protocolo

As células HUVEC são isoladas dos cordões umbilicais e usadas até a passagem 4. Os monócitos primários são isolados de doadores saudáveis de sangue total. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Jena, Jena, Alemanha (3939-12/13). De acordo com a Declaração de Helsinque, todos os indivíduos que doaram células para o estudo deram seu consentimento informado.

1. Dia 1: Preparação do biochip

1. Os biochips estão disponíveis em diferentes tamanhos e modelos. Para experimentos aqui, use o modelo BC002. Coloque o biochip em uma placa de Petri de vidro, encha a placa e lave todas as cavidades com etanol estéril a 70% (EthOH). Incubar durante 45 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as cavidades 2x com ddH₂O. Remova o ddH₂O.
2. Cubra a membrana do biochip de ambas as cavidades com solução estéril de colágeno IV (0,5 mg / mL em ácido acético 0,5 mM; use a concentração de 1:100 na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo magnésio e cálcio PBS (+/+)) lavando suavemente a solução de colágeno IV através de ambas as cavidades usando uma pipeta de 1.000 μL com pontas azuis. Incubar durante 15 min a 37 °C e 5% de CO₂.
   NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 1.000 μL com pontas de filtro azul (P1000) em todo o protocolo. O diâmetro da abertura da ponta do filtro cobre completamente a abertura das portas que conectam os canais, o que evita a inserção de bolhas de ar no chip.
3. Após 30 min de incubação, lave as câmaras inferior e superior 2x com PBS estéril (+/+) para eliminar o colágeno e o ácido acético restantes.
4. Prepare o meio EC adicionando 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL). Encha a câmara superior de cada cavidade com 250 μL de meio EC e a câmara inferior com 150 μL de meio EC.
5. Colha HUVEC de um frasco T25 confluente: Lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem PBS de magnésio e cálcio (-/-), adicione 1 mL de tripsina a 0,25% + 1 mM de EDTA em PBS (-/-) e incube por 3 min a 37 ° C. Interrompa a atividade da tripsina adicionando 5 mL de PBS (+/+) + 5% FCS e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) em um tubo cônico de 50 mL. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio EC.
6. Use uma diluição serial de 1:10 ao realizar a contagem de células. Adicione 10 μL do pellet celular ressuspenso a 90 μL de meio celular. Combine as amostras com cuidado. Use um tubo de microcentrífuga com 10 μL de corante azul de tripano. Diluir a solução celular com azul de tripano (1:1) utilizando lâminas de câmara de contagem de células. Conte as células manualmente com uma Câmara de Neubauer ou com um contador de células automatizado. Determine a contagem de células e ajuste a concentração para 0,4 x 10⁶ células por 200 μL.
7. Substituir o meio de células endoteliais na câmara superior do biochip por 200 μL de meio EC contendo HUVECs suspensos. Pipete suavemente para evitar a formação de bolhas de ar nos canais ou câmaras. Coloque a placa de Petri de vidro com os biochips a 37 °C e 5% de CO_2.

2. Dia 2: Verificação da camada celular

1. No dia 2, verifique visualmente a confluência da camada de células HUVEC na câmara superior. Realizar a troca do meio na câmara superior com 300 μL de meio EC. Pipete suavemente para evitar o descolamento das células da membrana. Realizar troca de mídia diariamente após 24h. Coloque a placa de Petri de vidro com os biochips de volta a 37 °C e 5% de CO₂.

3. Dia 3: Preparação da câmara inferior

1. Verifique visualmente a confluência da camada de células endoteliais. Neste ponto, determine a presença de uma camada confluente e morfologia semelhante a paralelepípedos (Figura 1). Realizar a troca do meio na câmara superior com 300 μL de meio EC.
2. Em seguida, prepare a câmara inferior para semear as células que formam a camada epitelial. Lave a câmara inferior suavemente com 150 μL do meio RPMI (adicione 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL), 5% de soro fetal de vaca, 1 μM de dexametasona).
3. Para a câmara inferior, semeie 0,5 x 10^{6 células} H441 suspensas em 200 μL de meio RPMI (RPMI) por cavidade.
4. Coleta de células H441
   1. Lave as células com 5 mL de PBS (-/-) uma vez. Adicione 2 mL de tripsina a 0,25% + 1 mM de EDTA em PBS (-/-).
   2. Incubar as células durante 5 min a 37 °C e 5% de CO₂. O tempo de incubação varia de acordo com a confluência da camada. Dentro de 5-7 min, as células devem se desprender completamente.
   3. Pare a atividade da tripsina com 10 mL de PBS (+/+) + 5% de FBS, colete as células e centrifugue a 200 x g por 4 min.
   4. Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 1 ml de RPMI e contar.
   5. Semeie 0,5 x 10⁶ células por câmara, pipetando suavemente a solução celular para a câmara inferior. Feche todas as portas e vire o biochip de cabeça para baixo para que as células possam se conectar à membrana PET. Manter o biochip de cabeça para baixo e incubar durante a noite numa incubadora de cultura de células a 37 °C e 5% de CO₂.

4. Dias 4 - Dia 7: Manutenção das células e colheita de monócitos

1. Realize a troca diária de meio na câmara superior e inferior. Para a câmara superior, realizar a troca do meio com 300 μL de meio EC.
2. Use 200 μL de RPMI+ (meio RPMI mais 1:100 (v/v) Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% de soro humano autólogo, 1 μM de dexametasona) para a câmara inferior. No dia 7, lave a câmara inferior com RPMI+ para preparar a cavidade para a semeadura de monócitos.
3. Semear 0,1 x 10⁶ monócitos suspensos em 200 μL RPMI+ na câmara inferior.
4. Colheita de monócitos
   1. Lave as células com 1 mL de PBS (-/-) e incube por 7 min a 37 ° C em PBS pré-aquecido (- / -) contendo 4 mg / mL de lidocaína + 5 mM de EDTA a 37 ° C e 5% de CO₂.
   2. Colete as células e centrifugue a 350 x g por 7 min, ressuspenda as células em 1mL de RPMI+ e conte. Coloque as portas do biochip voltadas para baixo para que as células se prendam à membrana.

5. Dia 8: Perfusão do biochip

1. Neste ponto, certifique-se de que os biochips estejam prontos para serem conectados ao fluxo e perfundidos. Antes de iniciar a perfusão, prepare uma incubadora vazia e coloque a bomba peristáltica dentro.
2. Perfusão dos biochips
   1. Antes de conectar o tubo esterilizado ao biochip, lave o tubo com 200 μL de PBS (+/+), seguido por 200 μL de meio EC. A tubulação tem um diâmetro interno de 0,5 mm, consistindo em lados mais longos (20 cm) e mais curtos (12 cm) divididos por duas rolhas de bomba peristálticas. Coloque a tubulação de lado e prepare os reservatórios para o meio.
   2. Efectuar a troca do meio nas câmaras superior e inferior, lavando-as com o respectivo meio de cultura celular recém-preparado.
   3. Insira o reservatório no lado de saída do biochip e conecte o reservatório com a tubulação à entrada do biochip (Figura 2). Conecte a tubulação ao reservatório e ao biochip para que haja uma perfusão média circular entre o reservatório e o biochip.
   4. Assim que tudo estiver conectado às portas, encha o reservatório com 500 μL de meio EC. Conecte o biochip com a tubulação em uma perfusão com uma vazão de 21 μL / min (Figura 2). Observe atentamente durante os primeiros 15 minutos de perfusão para a inserção de bolhas. Realize a troca média diariamente em ambas as câmaras.

6. Dia 9 - Dia 11: Estabelecendo uma interface ar-líquido

1. Pare a perfusão, esvazie os reservatórios e reabasteça com meio recém-preparado sob um gabinete de segurança estéril. Pipetar 500 μL de meio EC nos reservatórios e lavar suavemente a câmara inferior com 200 μL de RPMI+. Inicie a perfusão novamente com uma taxa de perfusão de 21 μL / min.
2. Interface Ar-Líquido (ALI)
   1. Estabelecer o ALI desde o dia 12 até ao final da experiência (dia 14). Durante a cultura de LPA, exponha as células epiteliais ao ar.
   2. Para estabelecer a cultura ALI, prepare um novo meio vascular EC (adicionar 1:100 (v / v) Penicilina / Estreptomicina (10.000 U / mL), 10 ng / ml GM-CSF, 20% de soro humano autólogo, 1μM de dexametasona) para manter todos os tipos de células no chip. Neste ponto, o meio contém uma concentração mais alta de AS (20%).
   3. Abra os plugues na câmara inferior sob um gabinete de segurança estéril e absorva cuidadosamente o meio até que uma bolha de ar seja visível, conforme mostrado na Figura 3. Certifique-se de que todo o líquido do canal e da câmara seja removido e feche as portas com cuidado.
   4. Encher os reservatórios com meio EC (-/-) e continuar a cultura de perfusão com um caudal de 21 μL/min. Troque o meio apenas na câmara superior até o dia 14 e mantenha as células epiteliais na câmara inferior apenas com ar.

7. Dia 14: Colheita e análise de tecidos

1. Desconecte o biochip do fluxo. Desligue a tubulação e verifique no microscópio se há confluência celular. Devido ao ar na câmara inferior, as camadas celulares podem parecer confusas e difíceis de visualizar. Neste ponto, o modelo está pronto para mais experimentações.
2. Fixação e coloração de tecido em biochip
   1. Lave as cavidades com PBS (+/+) para remover o meio de cultura celular. Pipetar 300 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% dissolvido em PBS (-/-) para a câmara superior e 200 μL na câmara inferior e incubar por 10 min em RT.
      NOTA: Ao trabalhar com produtos químicos de fixação, como PFA, use uma capela de exaustão. Colete e descarte os resíduos de acordo.
   2. Lave as câmaras 3x com PBS (+/+). Após a fixação, armazene os biochips a 4 °C ou use-os diretamente para coloração de imunofluorescência das células.
   3. Para permeabilização, pipetar 300 μL de Triton X-100 a 0,25% em PBS (+/+). Incubar por 30 min em RT.
   4. Após a incubação, lavar ambas as câmaras com PBS (+/+) e pipetar 300 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em PBS (+/+) em ambas as câmaras. Incubar por 1 h em RT.
   5. Enquanto isso, prepare o painel de anticorpos para coloração por imunofluorescência. Para preparar o painel de anticorpos para a coloração por imunofluorescência, foi instalado um tubo com quantidade suficiente de 3% de BSA para diluir os anticorpos. Use 50 μL de diluições de anticorpos para cada membrana. Utilizar uma razão de diluição de 1:100 para os painéis de anticorpos primários e de 1:200 para os painéis de anticorpos secundários. Além disso, para o painel de anticorpos secundários, prepare DAPI em uma proporção de diluição de 1:2.000. Para anticorpos correspondentes, consulte (Tabela 1).
   6. Para acessar diretamente as células dentro do biochip, a folha de ligação deve ser removida. Para abrir as câmaras microfluídicas, faça um corte exato na parte externa da cavidade e remova a folha de ligação. Corte a membrana removendo as bordas seladas ao biochip com o bisturi.
      NOTA: Trabalhe com precisão e precisão durante esta etapa para evitar danos à membrana e ferimentos devido à nitidez do bisturi.
   7. Depois de separar a membrana do biochip, divida a membrana em duas partes. Recolha os pedaços de membrana com uma pinça e coloque-os em uma lâmina microscópica para coloração.
   8. Pipetar 50 μL de solução de anticorpos por peça de membrana. Incubar durante a noite a 4 °C, protegido da luz.
   9. Após a incubação, coloque a membrana em 500 μL de PBS (-/-) em uma placa de 24 poços e lave a membrana 3x por 5 min cada em PBS (+/+). Após a lavagem, pipetar 50 μL de solução de anticorpo secundário e incubar por 1 h em RT protegido da luz.
   10. Lave a membrana com PBS (+/+) 3x por 5 min cada. Enquanto isso, prepare e rotule as lâminas microscópicas para o experimento. Coloque uma gota do meio de montagem na corrediça e coloque a membrana correspondente. Repita esta etapa para todas as membranas. No final, coloque mais uma gota do meio de montagem na parte superior da membrana e use uma lamínula. Conservar a 4 °C.

Resultados

Um exame das alterações morfológicas e da expressão de proteínas marcadoras pode ser realizado usando coloração de imunofluorescência. Após co-cultivo por 14 dias, os lados vascular e epitelial são analisados quanto à expressão dos respectivos marcadores celulares. Este método é útil para estudar as interações e integridade dos componentes vasculares e epiteliais, o que é essencial para a modelagem da doença como uma leitura biológica funcional relacionada à infecção. A coloração por imunofluores...

Discussão

O modelo alvéolo-em-chip representa um modelo de tecido multicamadas do alvéolo humano, integrando tipos de células essenciais do trato respiratório inferior, incluindo células epiteliais pulmonares, células endoteliais e macrófagos, cultivadas em um arranjo organotípico em um ALI com perfusão média do revestimento endotelial. Células de diferentes camadas expressam proteínas marcadoras celulares específicas, como a E-caderina, uma molécula de adesão dependente de cálcio das células epiteliais pulmonares...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss