需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

肺芯片模型通过模拟气液界面和内皮细胞灌注，模拟对肺生理学研究至关重要的血流和营养交换，超越了传统的 2D 培养。这增强了肺部研究的相关性，提供了一个动态的、生理准确的环境，以促进对呼吸道感染的理解和治疗。

摘要

我们介绍了一种先进的免疫活性肺芯片模型，旨在复制人类肺泡结构和功能。这种创新模型采用微流控灌注生物芯片，支持模拟人类肺泡环境的气液界面。组织工程用于整合关键细胞成分，包括内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞，以创建具有代表性的肺泡组织模型。该模型有助于深入检查粘膜对各种病原体（包括病毒、细菌和真菌）的免疫反应，从而促进我们对肺免疫的理解。该协议的主要目标是为将这种肺泡芯片模型建立为感染研究的强大 体外 平台提供细节，使研究人员能够密切观察和分析肺环境中病原体与宿主免疫系统之间的复杂相互作用。这是通过应用基于微流体的技术来模拟人类肺泡的关键生理条件来实现的，包括内皮细胞的血流和生物力学刺激，同时保持对上皮细胞实际暴露在空气中至关重要的气液界面。该模型系统与一系列标准化检测兼容，例如免疫荧光染色、细胞因子分析和集落形成单位 （CFU）/噬菌斑分析，从而可以全面了解感染期间的免疫动力学。Alphyolus-on-chip 由基本细胞类型组成，包括由多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 膜隔开的人远端肺上皮细胞 （H441） 和人脐静脉内皮细胞 （HUVEC），原代单核细胞衍生的巨噬细胞战略性地位于上皮层和内皮层之间。组织模型增强了在 体外剖析和分析涉及肺免疫反应的细微因素的能力。作为一种有价值的工具，它应该有助于肺部研究的进步，为研究呼吸道感染的发病机制和测试潜在的治疗干预措施提供更准确和动态的 体外 模型。

引言

人肺在呼吸和免疫防御中起着显著的作用，肺泡粘膜的免疫反应之间存在复杂的相互作用1。肺泡产生有效免疫反应的能力对于预防肺部感染和确保肺部健康至关重要。由于肺部经常暴露于各种潜在风险中，包括细菌、病毒、真菌、过敏和颗粒物，因此了解肺泡粘膜免疫反应的复杂性对于发现呼吸道感染、炎症性疾病和治疗肺部疾病背后的机制至关重要1。

为了在体外研究呼吸道的感染和炎症相关过程，需要能够忠实模拟肺泡环境和免疫反应的模型。几十年来，2D 细胞培养和动物模块一直被用作肺免疫反应生物医学研究的重要工具。然而，它们在对人类情况的转化潜力方面往往存在局限性。Lung-on-chip 模型有助于填补传统体外和体内模型之间的空白，并为研究人类特异性免疫反应提供了一种新方法 2,3。Lung-on-chip 模型可以模拟气液界面，这是肺细胞重现呼吸道生理状况并开发更准确和稳健的组织模型所必需的。这种培养技术能够在体外精确检查细胞分化、功能和对药物或疾病相关刺激的反应 2。

在这项研究中，我们提出了一种基于微流体的人类肺泡模型，作为....

研究方案

从脐带中分离 HUVEC 细胞并使用至第 4 代。原代单核细胞是从健康供体的全血中分离出来的。该研究得到了德国耶拿耶拿大学医院伦理委员会 （3939-12/13） 的批准。根据赫尔辛基宣言，所有为该研究捐献细胞的个人都给予了知情同意。

1. 第 1 天：准备生物芯片

  1. 生物芯片有不同的尺寸和型号。对于此处的实验，请使用型号 BC002。将生物芯片放入玻璃培养皿中，装满培养皿，并用无菌 70% 乙醇 （EthOH） 冲洗所有腔体。在室温下孵育 45 分钟。之后，用无菌 ddH2O 冲洗腔 2 次。去除 ddH2O。
  2. 使用带有蓝色吸头的 1,000 μL 移液管轻轻冲洗胶原蛋白 IV 溶液穿过两个腔体，用无菌胶原蛋白 IV 溶液（0.5 mg/mL 的 0.5 mM 乙酸溶液;使用 1：100 浓度的含镁和钙 PBS 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （+/+））包被两个腔体的生物芯片膜。在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 15 分钟。
    注：建议在整个方案中使用带蓝色过滤器 （P1000） 吸头的 1,000 μL 移液器。过滤器尖端开口的直径完全覆盖了连接通道的端口开口，从而避免了气泡插入芯片。
  3. 孵育 30 分钟后，用无菌 PBS （+/+） 冲洗下腔室和上腔室 2 次，以冲洗掉剩余的胶原蛋白和乙酸。

代表性结果

可以使用免疫荧光染色检查形态改变和标记蛋白的表达。共培养 14 天后，分析血管侧和上皮侧各自细胞标志物的表达。该方法可用于研究血管和上皮成分的相互作用和完整性，这对于作为与感染相关的功能性生物学读数的疾病建模至关重要。免疫荧光染色可以通过定量分析、形态学评估和功能测定来支持，包括细胞因子释放、细胞死亡标志物（如 LDH 释放）的流出分析以及细胞形态计量学的变化<.......

讨论

肺泡芯片模型代表了人肺泡的多层组织模型，整合了下呼吸道的基本细胞类型，包括肺上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞，在 ALI 以器官型排列培养，内皮衬里有中等灌注。不同层的细胞表达特定的细胞标志物蛋白，例如 E-钙粘蛋白，这是一种肺上皮细胞的钙依赖性粘附分子，在建立细胞间上皮屏障中处于核心地位 5,10。E-钙粘蛋白形成物理屏障元件并控?.......

披露声明

K.R. 是 Dynamic42 GmbH 的首席执行官，持有该公司的股份。A.S.M. 是 Dynamic 42 GmbH 的科学顾问，并持有该公司的股权。所有其他作者都没有利益冲突。

致谢

H.K. 和 A.S.M. 感谢 Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena 的资助，该资助由莱布尼茨协会战略网络资助。M.A. 和 A.S.M. 得到了德国联邦议院决议资助的 IGF 项目 IMPROVE 的支持。A.S.M 进一步感谢德国卓越战略 - EXC 2051 - 项目 ID 690 390713860 下微宇宙卓越平衡集群的财政支持。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)InvitrogenC10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592
Eco wipesDr. Schuhmacher00-915-REW10003-01
Eppies 2.0Sarstedt72.691
Eppis 0.5Sarstedt72.699
Eppis 1.5Sarstedt72.690.001
Falcons 15mLGreiner Bio-One188 271-TRI
Falcons 50mLGreiner Bio-One227 261-TRI
Gauze swabNobaPZN 2417767
Gloves Nitril 3000Meditrade1280
Microscope slidesMenzel-GläserAAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mmAssistent40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mmAssistent40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)Falcon352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mmSarstedt85.1637.235
ScalpelsDahlhausen11.000.00.715
Serological pipettes 10mLGreiner Bio-One607 160-TRI
Serological pipettes 25mLGreiner Bio-One760 160-TRI
Serological pipettes 2mLGreiner Bio-One710 160-TRI
Serological pipettes 50mLGreiner Bio-One768 160-TRI
Serological pipettes 5mLGreiner Bio-One606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-GelSarstedt1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3ESarstedt02.1066.001
Softasept NBraun3887138
T25 flaskGreiner Bio-One690 960
Tips sterile 10µLGreiner Bio-One771 261
Tips sterile 1250µLGreiner Bio-One750 261
Tips sterile 300µLGreiner Bio-One738 261
Tips unsterile 10µLGreiner Bio-One765 290
Tips unsterile 1000µLGreiner Bio-One739 291
Tips unsterile 200µLGreiner Bio-One686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1
Chemicals
Descosept AFDr. SchuhmacherN-20338
Ethanol 96%Nordbrand-Nordhausen410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)Sigma AldrichFD4-100MG
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
MethanolVWR20847.295
SaponinFluka47036
TergazymeAlconox1304-1
Cell culture
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG
DexametasonSigma-AldrichD4902
DPBS (-/-)LonzaBE17-516F
DPBS (+/+)LonzaBE17-513F
EDTA solutionSigma-AldrichE788S
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225
Fetal bovine SerumSigma-AldrichE2129-10g
H441ATCC
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30
LidocainSigma-AldrichL5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122 /-163
RPMIGibco72400047
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282
TrypsinGibco15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)BD610252
CD68 (rabbit)CellSignaling76437
E-Cadherin (goat)R&DAF748
SP-A (mouse)Abcamab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)InvitrogenR37114
AF647 (donkey anti mouse)invitrogenA31571
AF647 (donkey anti rabbit)InvitrogenA31573
Cy3 (donkey anti goat)jackson research705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
Microfluidic
ChipDynamic 42BC002
Male Luer Lock (small)ChipShop09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, greenMicrofluidic chipshop09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, redMicrofluidic chipshop09-0557-0336-10
PlugsCole ParmerGZ-45555-56
Reservoir 4.5mLChipShop16-0613-0233-09
TubingDynamic 42ST001
Equipment
AutoclaveTuttnauer5075 ELV
CentrifugeEppendorf5424
CO2 IncubatorHeracell150i
Countess automated cell counterInvitrogenC10227
FlowcytometerBDFACS Canto II
Freezer (-20 °C)LiebherrLCexv 4010
Freezer (-80 °C)HeraeusHerafreeze HFU 686
FridgeLiebherrLCexv 4010
Heraeus MultifugeThermo ScientificX3R
MicroscopeLeicaDM IL LED
Orbital shakerHeidolphReax2000
Peristaltic pumpREGLO Digital MS-4/12ISM597D
Pipettes 10µLEppendorf Research plus3123000020
Pipettes 100µLEppendorf Research plus3123000047
Pipettes 1000µLEppendorf Research plus3123000063
Pipettes 2.5µLEppendorf Research plus3123000012
Pipettes 20µLEppendorf Research plus3123000039
Pipettes 200µLEppendorf Research plus3123000055
ScaleSartorius6101
ScaleSartoriusTE1245
Sterile benchKojairBiowizard SL-130
WaterbathJulaboSW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2Zeiss
Illumination deviceZeissHXP 120 C
MicroscopeZeissAxio Observer 5
Optical SectioningZeissApoTome
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232
Software
ZEN Blue EditionZeiss

参考文献

  1. Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
  2. Artzy-Schnirman, A., et al.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

H441 HUVECs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。