用于研究肺泡粘膜免疫反应的免疫活性 Alphyolus-on-Chip 模型

摘要

肺芯片模型通过模拟气液界面和内皮细胞灌注，模拟对肺生理学研究至关重要的血流和营养交换，超越了传统的 2D 培养。这增强了肺部研究的相关性，提供了一个动态的、生理准确的环境，以促进对呼吸道感染的理解和治疗。

摘要

我们介绍了一种先进的免疫活性肺芯片模型，旨在复制人类肺泡结构和功能。这种创新模型采用微流控灌注生物芯片，支持模拟人类肺泡环境的气液界面。组织工程用于整合关键细胞成分，包括内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞，以创建具有代表性的肺泡组织模型。该模型有助于深入检查粘膜对各种病原体（包括病毒、细菌和真菌）的免疫反应，从而促进我们对肺免疫的理解。该协议的主要目标是为将这种肺泡芯片模型建立为感染研究的强大 体外 平台提供细节，使研究人员能够密切观察和分析肺环境中病原体与宿主免疫系统之间的复杂相互作用。这是通过应用基于微流体的技术来模拟人类肺泡的关键生理条件来实现的，包括内皮细胞的血流和生物力学刺激，同时保持对上皮细胞实际暴露在空气中至关重要的气液界面。该模型系统与一系列标准化检测兼容，例如免疫荧光染色、细胞因子分析和集落形成单位 （CFU）/噬菌斑分析，从而可以全面了解感染期间的免疫动力学。Alphyolus-on-chip 由基本细胞类型组成，包括由多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 膜隔开的人远端肺上皮细胞 （H441） 和人脐静脉内皮细胞 （HUVEC），原代单核细胞衍生的巨噬细胞战略性地位于上皮层和内皮层之间。组织模型增强了在 体外剖析和分析涉及肺免疫反应的细微因素的能力。作为一种有价值的工具，它应该有助于肺部研究的进步，为研究呼吸道感染的发病机制和测试潜在的治疗干预措施提供更准确和动态的 体外 模型。

引言

人肺在呼吸和免疫防御中起着显著的作用，肺泡粘膜的免疫反应之间存在复杂的相互作用¹。肺泡产生有效免疫反应的能力对于预防肺部感染和确保肺部健康至关重要。由于肺部经常暴露于各种潜在风险中，包括细菌、病毒、真菌、过敏和颗粒物，因此了解肺泡粘膜免疫反应的复杂性对于发现呼吸道感染、炎症性疾病和治疗肺部疾病背后的机制至关重要¹。

为了在体外研究呼吸道的感染和炎症相关过程，需要能够忠实模拟肺泡环境和免疫反应的模型。几十年来，2D 细胞培养和动物模块一直被用作肺免疫反应生物医学研究的重要工具。然而，它们在对人类情况的转化潜力方面往往存在局限性。Lung-on-chip 模型有助于填补传统体外和体内模型之间的空白，并为研究人类特异性免疫反应提供了一种新方法 ^2,3。Lung-on-chip 模型可以模拟气液界面，这是肺细胞重现呼吸道生理状况并开发更准确和稳健的组织模型所必需的。这种培养技术能够在体外精确检查细胞分化、功能和对药物或疾病相关刺激的反应 ²。

在这项研究中，我们提出了一种基于微流体的人类肺泡模型，作为一种有效的工具，通过应用灌注来模拟内皮细胞的血流和生物力学刺激，并将气液界面与暴露于空气相⁴ 的上皮细胞相结合。我们开发了一种微流控灌注芯片肺泡，它模拟了人类肺泡的物理结构和生物相互作用，特别关注气液界面。该界面在呼吸道上皮细胞的分化中起着至关重要的作用，这对于准确模拟肺环境至关重要。该模型使用人远端肺上皮细胞 （H441） 和人脐静脉内皮细胞 （HUVEC），由多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 膜隔开，原代单核细胞衍生的巨噬细胞位于细胞层之间。这种设置复制了肺泡错综复杂的细胞排列，对于准确模拟气液界面至关重要，气液界面是肺组织生理功能的重要因素。

模型开发背后的基本原理延伸到整合循环和组织驻留免疫细胞。这种方法旨在准确模拟炎症宿主对人类呼吸道感染的反应，为研究病原体-宿主相互作用提供动态环境。巨噬细胞的存在允许检查即时免疫反应及其与病原体的相互作用，反映了抵御呼吸道感染的第一道防线。此外，生物芯片平台的设计有助于方便和精确地操纵生物物理和生化线索，这对于 在体外复制肺泡功能至关重要。这种灵活性有助于剖析导致人类感染的因素，使研究人员能够调整条件以反映各种疾病状态或测试潜在的治疗干预措施。该平台与多种读出技术（包括先进的显微镜、微生物分析和生化污水分析）的兼容性增强了其实用性。这些功能允许全面评估组织对感染的反应，包括评估细胞行为、病原体增殖和免疫反应的有效性。

我们提出了一个详细的协议和技术来创建和利用人类肺泡芯片模型，该模型专注于复制气液界面和整合免疫细胞以在体外研究人类感染。

研究方案

从脐带中分离 HUVEC 细胞并使用至第 4 代。原代单核细胞是从健康供体的全血中分离出来的。该研究得到了德国耶拿耶拿大学医院伦理委员会 （3939-12/13） 的批准。根据赫尔辛基宣言，所有为该研究捐献细胞的个人都给予了知情同意。

1. 第 1 天：准备生物芯片

1. 生物芯片有不同的尺寸和型号。对于此处的实验，请使用型号 BC002。将生物芯片放入玻璃培养皿中，装满培养皿，并用无菌 70% 乙醇 （EthOH） 冲洗所有腔体。在室温下孵育 45 分钟。之后，用无菌 ddH₂O 冲洗腔 2 次。去除 ddH₂O。
2. 使用带有蓝色吸头的 1,000 μL 移液管轻轻冲洗胶原蛋白 IV 溶液穿过两个腔体，用无菌胶原蛋白 IV 溶液（0.5 mg/mL 的 0.5 mM 乙酸溶液;使用 1：100 浓度的含镁和钙 PBS 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （+/+））包被两个腔体的生物芯片膜。在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 15 分钟。
   注：建议在整个方案中使用带蓝色过滤器 （P1000） 吸头的 1,000 μL 移液器。过滤器尖端开口的直径完全覆盖了连接通道的端口开口，从而避免了气泡插入芯片。
3. 孵育 30 分钟后，用无菌 PBS （+/+） 冲洗下腔室和上腔室 2 次，以冲洗掉剩余的胶原蛋白和乙酸。
4. 通过添加 1：100 （v/v） 青霉素/链霉素 （10,000 U/mL） 来制备 EC 培养基。用 250 μL 的 EC 培养基填充每个腔体的上腔室，用 150 μL 的 EC 培养基填充下腔室。
5. 从汇合的 T25 培养瓶中收获 HUVEC：用 5 mL 不含镁和钙 PBS （-/-） 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水洗涤，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶 + 1 mM EDTA 的 PBS （-/-） 溶液，并在 37 °C 下孵育 3 分钟。 加入 5 mL PBS （+/+） + 5% FCS，并在室温 （RT） 下在 50 mL 锥形管中以 350 x g 离心 5 分钟，终止胰蛋白酶活性。去除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL EC 培养基中。
6. 进行细胞计数时使用 1：10 的连续稀释液。将 10 μL 重悬的细胞沉淀添加到 90 μL 细胞培养基中。仔细混合样品。使用含有 10 μL 台盼蓝染色剂的微量离心管。使用细胞计数室载玻片，用台盼蓝 （1：1） 稀释细胞溶液。使用 Neubauer 腔室或自动细胞计数仪手动计数细胞。测定细胞计数并将浓度调整为每 200 μL 0.4 x 10⁶ 个细胞。
7. 用 200 μL 含有悬浮 HUVEC 的 EC 培养基替换生物芯片上腔室中的内皮细胞培养基。轻轻移液以避免在通道或腔室中形成气泡。将装有生物芯片的玻璃培养皿置于 37 °C 和 5% CO_{2 下。}

2. 第 2 天：检查细胞层

1. 第 2 天，目视检查上腔室中 HUVEC 细胞层的汇合度。在上腔室中用 300 μL EC 培养基进行培养基更换。轻轻移液以避免细胞从膜上脱落。每天 24 小时后执行媒体交换。将装有生物芯片的玻璃培养皿放回 37 °C 和 5% CO₂ 下。

3. 第 3 天：准备下腔室

1. 目视检查内皮细胞层的汇合度。此时，确定汇合层和鹅卵石状形态的存在（图 1）。在上腔室中用 300 μL EC 培养基进行培养基更换。
2. 接下来，准备下腔室以接种形成上皮层的细胞。用 150 μL RPMI 培养基（添加 1：100 （v/v） 青霉素/链霉素 （10,000 U/mL）、5% 胎牛血清、1 μM 地塞米松）轻轻冲洗下腔室。
3. 对于下腔室，接种 0.5 x 10⁶ 个 H441 细胞，悬浮在每个腔 200 μL RPMI 培养基 （RPMI） 中。
4. 收获 H441 细胞
   1. 用 5 mL PBS （-/-） 洗涤细胞一次。在 PBS 中加入 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶 + 1 mM EDTA （-/-）。
   2. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 5 分钟。孵育时间根据层的汇合度而变化。在 5-7 分钟内，细胞应完全分离。
   3. 用 10 mL PBS （+/+） + 5% FBS 终止胰蛋白酶活性，收集细胞，并以 200 x g 离心 4 分钟。
   4. 离心后，弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL RPMI 中，并计数。
   5. 通过将细胞溶液轻轻移液到下腔室中，每个腔室接种 0.5 x 10⁶ 个细胞。关闭所有端口并将生物芯片倒置，以便细胞可以附着在 PET 膜上。将生物芯片倒置，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育过夜。

4. 第 4 天 - 第 7 天：维持细胞和收获单核细胞

1. 在上下腔室进行每日培养基更换。对于上腔室，用 300 μL EC 培养基进行培养基更换。
2. 使用 200 μL RPMI + （RPMI 培养基加 1：100 （v/v） 青霉素/链霉素 （10,000 U/mL）、10 ng/mL GM-CSF、10% 自体人血清、1 μM 地塞米松）用于下腔室。第 7 天，用 RPMI + 冲洗下腔，以准备用于接种单核细胞的腔。
3. 在下腔室中接种 0.1 x 10⁶ 个悬浮在 200 μL RPMI+ 中的单核细胞。
4. 收获单核细胞
   1. 用 1 mL PBS （-/-） 洗涤细胞，并在 37 °C 下在预热的 PBS （-/-） 中孵育 7 分钟，其中含有 4 mg/mL 利多卡因 + 5 mM EDTA，在 37 °C 和 5% CO₂ 下。
   2. 收集细胞并以 350 x g 离心 7 分钟，将细胞重悬于 1 mL RPMI + 中，并计数。将生物芯片端口朝下放置，使细胞附着在膜上。

5. 第 8 天：生物芯片灌注

1. 此时，确保生物芯片已准备好连接到流式细胞流和灌注。在开始灌注之前，准备一个空的培养箱并将蠕动泵放入其中。
2. 生物芯片的灌注
   1. 在将灭菌管连接到生物芯片之前，先用 200 μL PBS （+/+） 冲洗管，然后用 200 μL EC 培养基冲洗管。管子的内径为 0.5 mm，由较长 （20 cm） 和较短 （12 cm） 的侧面组成，由两个蠕动泵塞隔开。将管路放在一边，为培养基准备储液槽。
   2. 通过用相应的新鲜制备的细胞培养基冲洗上下腔室，在上腔室和下腔室中进行培养基交换。
   3. 将储液槽插入生物芯片的出口侧，并将储液槽与管道连接到生物芯片的入口（图 2）。将管道连接到储液槽和生物芯片，以便在储液槽和生物芯片之间有圆形培养基灌注。
   4. 将所有设备都连接到端口后，用 500 μL EC 培养基填充储液槽。将生物芯片与灌注上的管道连接，流速为 21 μL/min（图 2）。在灌注的前 15 分钟内密切观察气泡的插入情况。每天在两个腔室中进行培养基更换。

6. 第 9 天 - 第 11 天：建立气液界面

1. 停止灌注，清空储液槽，并在无菌安全柜下重新填充新鲜制备的培养基。将 500 μL EC 培养基移液到储液槽中，并用 200 μL RPMI+ 轻轻冲洗下腔室。以 21 μL/min 的灌注速率再次开始灌注。
2. 气液界面 （ALI）
   1. 从第 12 天到实验结束（第 14 天）建立 ALI。在 ALI 培养过程中，将上皮细胞暴露在空气中。
   2. 为了建立 ALI 培养物，制备新的血管培养基 EC（添加 1：100 （v/v） 青霉素/链霉素 （10,000 U/mL）、10 ng/ml GM-CSF、20% 自体人血清、1 μM 地塞米松）以维持芯片中的所有细胞类型。此时，培养基中含有较高浓度的 AS （20%）。
   3. 打开无菌安全柜下腔室的塞子，小心吸收培养基，直到看到气泡，如图 3 所示。确保通道和腔室中的整个液体都已取出，并小心关闭端口。
   4. 用 EC （-/-） 培养基填充储液槽，并以 21 μL/min 的流速继续灌流培养。仅在上腔室交换培养基直到第 14 天，并将上皮细胞保持在下腔室中，仅用空气。

7. 第 14 天：组织收获和分析

1. 断开生物芯片与流式细胞的连接。塞出管路并在显微镜上检查细胞汇合。由于下腔室中的空气，细胞层可能看起来模糊且难以观察。此时，模型已准备好进行进一步试验。
2. 生物芯片中组织的固定和染色
   1. 用 PBS （+/+） 清洗空腔以去除细胞培养基。将 300 μL 溶解在 PBS （-/-） 中的 4% 多聚甲醛 （PFA） 移液至上腔，将 200 μL 移至下腔，并在室温下孵育 10 分钟。
      注：使用 PFA 等固定化学品时，请使用通风橱。相应地收集和处理废物。
   2. 用 PBS （+/+） 洗涤腔室 3 次。固定后，将生物芯片储存在 4 °C 或直接用于细胞的免疫荧光染色。
   3. 对于透化，移液 300 μL 0.25% Triton X-100 的 PBS 溶液 （+/+）。在 RT 孵育 30 分钟。
   4. 孵育后，用 PBS （+/+） 洗涤两个腔室，并在两个腔室中移液 300 μL 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBS （+/+） 溶液。在 RT 下孵育 1 小时。
   5. 同时，准备用于免疫荧光染色的抗体组合。为了制备用于免疫荧光染色的抗体组合，设置了一根含有足够量 3% BSA 的试管来稀释抗体。每个膜使用 50 μL 抗体稀释液。一抗检测组使用 1：100 的稀释比，二抗检测组使用 1：200 的稀释比。此外，对于二抗组合，以 1：2,000 的稀释比例制备 DAPI。有关相应的抗体，请参见（表 1）。
   6. 要直接接触生物芯片内的细胞，必须去除粘合箔。要打开微流体室，请在腔体外部进行精确切割并去除粘合箔。通过用手术刀去除密封在生物芯片上的边缘来切出膜。
      注意：在此步骤中精确和准确地工作，以避免因手术刀的锋利度而造成任何膜损伤和伤害。
   7. 将膜从生物芯片上拆下后，将膜分成两部分。用镊子收集膜片，并将它们放在显微镜载玻片上进行染色。
   8. 每个膜片吸取 50 μL 抗体溶液。在 4 °C 下避光孵育过夜。
   9. 孵育后，将膜置于 24 孔板中的 500 μL PBS （-/-） 中，并在 PBS （+/+） 中洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。洗涤后，吸取 50 μL 二抗溶液，并在避光室下孵育 1 小时。
   10. 用 PBS （+/+） 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。同时，准备并标记用于实验的显微载玻片。在载玻片上滴一滴封固剂，并放置相应的膜。对所有膜重复此步骤。最后，在膜顶部再滴一滴封固剂，并使用盖玻片。储存在 4 °C。

结果

可以使用免疫荧光染色检查形态改变和标记蛋白的表达。共培养 14 天后，分析血管侧和上皮侧各自细胞标志物的表达。该方法可用于研究血管和上皮成分的相互作用和完整性，这对于作为与感染相关的功能性生物学读数的疾病建模至关重要。免疫荧光染色可以通过定量分析、形态学评估和功能测定来支持，包括细胞因子释放、细胞死亡标志物（如 LDH 释放）的流出分析以及细胞形态计量学的变化<...

讨论

肺泡芯片模型代表了人肺泡的多层组织模型，整合了下呼吸道的基本细胞类型，包括肺上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞，在 ALI 以器官型排列培养，内皮衬里有中等灌注。不同层的细胞表达特定的细胞标志物蛋白，例如 E-钙粘蛋白，这是一种肺上皮细胞的钙依赖性粘附分子，在建立细胞间上皮屏障中处于核心地位 ^5,10。E-钙粘蛋白形成物理屏障元件并控?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss