Modelo de alvéolo en chip inmunocompetente para el estudio de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar

Resumen

Los modelos de pulmón en chip superan a los cultivos 2D tradicionales al imitar la interfaz aire-líquido y la perfusión de células endoteliales, simulando el flujo sanguíneo y el intercambio de nutrientes cruciales para los estudios de fisiología pulmonar. Esto aumenta la relevancia de la investigación pulmonar, ya que ofrece un entorno dinámico y fisiológicamente preciso para avanzar en la comprensión y el tratamiento de las infecciones respiratorias.

Resumen

Presentamos un modelo avanzado de pulmón en chip inmunocompetente diseñado para replicar la estructura y función alveolar humana. Este innovador modelo emplea un biochip perfundido microfluídicamente que admite una interfaz aire-líquido que imita el entorno en los alvéolos humanos. La ingeniería de tejidos se utiliza para integrar componentes celulares clave, incluidas las células endoteliales, los macrófagos y las células epiteliales, para crear un modelo de tejido representativo del alvéolo. El modelo facilita el examen en profundidad de las respuestas inmunitarias de la mucosa a diversos patógenos, incluidos virus, bacterias y hongos, avanzando así en nuestra comprensión de la inmunidad pulmonar. El objetivo principal de este protocolo es proporcionar detalles para establecer este modelo de alvéolo en chip como una plataforma in vitro robusta para estudios de infección, lo que permite a los investigadores observar y analizar de cerca las complejas interacciones entre los patógenos y el sistema inmunológico del huésped dentro del entorno pulmonar. Esto se logra mediante la aplicación de técnicas basadas en microfluídica para simular las condiciones fisiológicas clave de los alvéolos humanos, incluido el flujo sanguíneo y la estimulación biomecánica de las células endoteliales, junto con el mantenimiento de una interfaz aire-líquido crucial para la exposición realista de las células epiteliales al aire. El sistema modelo es compatible con una serie de ensayos estandarizados, como la tinción de inmunofluorescencia, el perfil de citocinas y el análisis de unidades formadoras de colonias (UFC)/placa, lo que permite obtener información completa sobre la dinámica inmunitaria durante la infección. El alvéolo en chip está compuesto por tipos de células esenciales, incluidas las células epiteliales pulmonares distales humanas (H441) y las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), con macrófagos primarios derivados de monocitos estratégicamente ubicados entre las capas epitelial y endotelial. El modelo de tejido mejora la capacidad de diseccionar y analizar los factores matizados implicados en las respuestas inmunitarias pulmonares in vitro. Como herramienta valiosa, debería contribuir al avance de la investigación pulmonar, proporcionando un modelo in vitro más preciso y dinámico para estudiar la patogénesis de las infecciones respiratorias y probar posibles intervenciones terapéuticas.

Introducción

El pulmón humano tiene un papel notable en la respiración y la defensa inmunitaria, con interacciones complejas entre las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar¹. La capacidad de los alvéolos para crear una respuesta inmunitaria eficiente es vital para prevenir infecciones pulmonares y garantizar la salud pulmonar. Dado que los pulmones están constantemente expuestos a una amplia gama de riesgos potenciales, incluidas bacterias, virus, hongos, alergias y partículas, comprender las complejidades de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar es fundamental para descubrir los mecanismos detrás de las infecciones respiratorias, los trastornos inflamatorios y el tratamiento^{de las enfermedades} pulmonares.

Para estudiar in vitro los procesos relacionados con la infección y la inflamación de las vías respiratorias, se requieren modelos que puedan imitar fielmente el medio alveolar y las respuestas inmunitarias. Los módulos de cultivo celular y animal en 2D se han utilizado durante décadas como herramientas esenciales para la investigación biomédica sobre la respuesta inmunitaria pulmonar. Sin embargo, a menudo tienen limitaciones en su potencial de traducción a situaciones humanas. Los modelos lung-on-chip pueden contribuir a llenar el vacío entre los modelos tradicionales in vitro e in vivo y proporcionar un enfoque novedoso para estudiar las respuestas inmunitarias específicas de los humanos ^2,3. Los modelos de pulmón en chip pueden imitar la interfaz aire-líquido, que es necesaria para que las células pulmonares recapitulen las condiciones fisiológicas del tracto respiratorio y desarrollen un modelo de tejido más preciso y robusto. Esta técnica de cultivo permite un examen preciso de la diferenciación, el funcionamiento y las respuestas celulares a fármacos o estímulos relacionados con enfermedades in vitro².

En este estudio, presentamos un modelo basado en microfluídica del alvéolo humano como una herramienta eficaz para recapitular el medio alveolar humano mediante la aplicación de perfusión para imitar el flujo sanguíneo y la estimulación biomecánica de las células endoteliales e incorporando una interfaz aire-líquido con células epiteliales expuestas hacia una fase^{de aire 4}. Hemos desarrollado un alvéolo microfluídico perfundido en chip que imita la estructura física y las interacciones biológicas del alvéolo humano, con un enfoque particular en la interfaz aire-líquido. Esta interfaz desempeña un papel crucial en la diferenciación de las células epiteliales respiratorias, que es esencial para modelar con precisión el entorno pulmonar. El modelo utiliza células epiteliales pulmonares distales humanas (H441) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), con macrófagos primarios derivados de monocitos colocados entre las capas celulares. Esta configuración replica la intrincada disposición celular del alvéolo y es fundamental para simular con precisión la interfaz aire-líquido, que es un factor importante en la función fisiológica del tejido pulmonar.

La razón de ser del desarrollo del modelo se extiende a la integración de las células inmunitarias circulantes y residentes en los tejidos. Este enfoque está diseñado para imitar con precisión la respuesta inflamatoria del huésped a las infecciones respiratorias humanas, proporcionando un entorno dinámico para estudiar las interacciones patógeno-huésped. La presencia de macrófagos permite examinar las respuestas inmunitarias inmediatas y su interacción con los patógenos, lo que refleja la primera línea de defensa contra las infecciones respiratorias. Además, el diseño de la plataforma de biochip facilita la manipulación cómoda y precisa de las señales biofísicas y bioquímicas, lo que es crucial para replicar la función de los alvéolos in vitro. Esta flexibilidad es fundamental para diseccionar los factores que contribuyen a las infecciones humanas, lo que permite a los investigadores ajustar las condiciones para reflejar diversos estados de enfermedad o probar posibles intervenciones terapéuticas. La compatibilidad de la plataforma con múltiples tecnologías de lectura, incluida la microscopía avanzada, los análisis microbiológicos y el análisis bioquímico de efluentes, mejora su utilidad. Estas capacidades permiten una evaluación exhaustiva de la respuesta de los tejidos a las infecciones, incluida la evaluación del comportamiento celular, la proliferación de patógenos y la eficacia de las respuestas inmunitarias.

Presentamos un protocolo detallado y técnicas para crear y utilizar un modelo de alvéolo humano en chip centrado en replicar la interfaz aire-líquido e integrar células inmunitarias para estudiar las infecciones humanas in vitro.

Protocolo

Las células HUVEC se aíslan de los cordones umbilicales y se utilizan hasta el paso 4. Los monocitos primarios se aíslan de donantes sanos a partir de sangre entera. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Universitario de Jena, Jena, Alemania (3939-12/13). De acuerdo con la Declaración de Helsinki, todas las personas que donaron células para el estudio dieron su consentimiento informado.

1. Día 1: Preparación del biochip

1. Los biochips están disponibles en diferentes tamaños y modelos. Para los experimentos aquí, use el modelo BC002. Coloque el biochip en una placa de Petri de vidrio, llene la placa y enjuague todas las cavidades con etanol estéril al 70% (EthOH). Incubar durante 45 min a temperatura ambiente. A continuación, enjuague las cavidades 2 veces con ddH₂O. Estéril Retire el ddH₂O.
2. Cubra la membrana del biochip de ambas cavidades con una solución intravenosa estéril de colágeno (0,5 mg/ml en ácido acético 0,5 mM; utilice una concentración de 1:100 en la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene PBS de magnesio y calcio (+/+)) enjuagando suavemente la solución de colágeno IV a través de ambas cavidades utilizando una pipeta de 1.000 μL con puntas azules. Incubar durante 15 min a 37 °C y 5% de_CO2.
   NOTA: Se recomienda utilizar una pipeta de 1.000 μL con puntas de filtro azul (P1000) durante todo el protocolo. El diámetro de la abertura de la punta del filtro cubre completamente la apertura de los puertos que conectan los canales, lo que evita la inserción de burbujas de aire en el chip.
3. Después de 30 minutos de incubación, enjuague las cámaras inferior y superior 2 veces con PBS estéril (+/+) para eliminar el colágeno y el ácido acético restantes.
4. Prepare el medio EC añadiendo penicilina/estreptomicina 1:100 (v/v) (10.000 U/mL). Llene la cámara superior de cada cavidad con 250 μL de medio EC y la cámara inferior con 150 μL de medio EC.
5. Cosechar HUVEC de un matraz T25 confluente: Lavar con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin PBS de magnesio y calcio (-/-), añadir 1 mL de tripsina al 0,25% + 1 mM de EDTA en PBS (-/-) e incubar durante 3 min a 37 °C. Detenga la actividad de la tripsina añadiendo 5 mL de PBS (+/+) + 5% FCS y centrifugue a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) en un tubo cónico de 50 mL. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 1 mL de medio EC.
6. Utilice una dilución en serie 1:10 cuando realice el recuento de células. Añada 10 μL del pellet de célula resuspendida a 90 μL de medio celular. Combine las muestras con cuidado. Utilice un tubo de microcentrífuga con 10 μL de tinte azul de tripano. Diluya la solución celular con azul de tripán (1:1) utilizando portaobjetos de la cámara de recuento de células. Cuente las células manualmente con una cámara de Neubauer o con un contador de células automatizado. Determine el recuento de células y ajuste la concentración a 0,4 x 10⁶ células por 200 μL.
7. Sustituya el medio de células endoteliales en la cámara superior del biochip por 200 μL de medio EC que contenga HUVEC en suspensión. Pipetear suavemente para evitar la formación de burbujas de aire en los canales o cámaras. Coloque la placa de Petri de vidrio con los biochips a 37 °C y 5% de CO_2.

2. Día 2: Comprobación de la capa celular

1. El día 2, compruebe visualmente la confluencia de la capa de células HUVEC en la cámara superior. Realice el intercambio de medio en la cámara superior con 300 μL de medio EC. Pipetear suavemente para evitar el desprendimiento de células de la membrana. Realice el intercambio de medios diariamente después de 24 horas. Vuelva a colocar la placa de Petri de vidrio con los biochips a 37 °C y 5% de_CO2.

3. Día 3: Preparación de la cámara inferior

1. Comprobar visualmente la confluencia de la capa de células endoteliales. En este punto, determine la presencia de una capa confluente y una morfología similar a un adoquín (Figura 1). Realice el intercambio de medio en la cámara superior con 300 μL de medio EC.
2. A continuación, prepare la cámara inferior para sembrar las células que forman la capa epitelial. Enjuague suavemente la cámara inferior con 150 μL del medio RPMI (agregue 1:100 (v/v) de penicilina/estreptomicina (10,000 U/mL), suero fetal de vaca al 5%, 1 μM de dexametasona).
3. Para la cámara inferior, siembra 0,5 x 10^{6 células} H441 suspendidas en 200 μL de medio RPMI (RPMI) por cavidad.
4. Recolección de células H441
   1. Lave las células con 5 mL de PBS (-/-) una vez. Añadir 2 mL de tripsina al 0,25% + 1 mM de EDTA en PBS (-/-).
   2. Incubar las células durante 5 min a 37 °C y 5% de CO₂. El tiempo de incubación varía en función de la confluencia de la capa. En 5-7 minutos, las células deberían desprenderse por completo.
   3. Detenga la actividad de tripsina con 10 mL de PBS (+/+) + 5% de FBS, recoja las células y centrifugue a 200 x g durante 4 min.
   4. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de RPMI y cuente.
   5. Siembre 0,5 x 10⁶ células por cámara pipeteando suavemente la solución celular en la cámara inferior. Cierre todos los puertos y voltee el biochip al revés para que las células puedan adherirse a la membrana PET. Mantenga el biochip boca abajo e incube durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂.

4. Día 4 - Día 7: Mantenimiento de células y recolección de monocitos

1. Realice el intercambio diario de medios en la cámara superior e inferior. Para la cámara superior, realice el intercambio de medio con 300 μL de medio EC.
2. Utilice 200 μL de RPMI+ (medio RPMI más 1:100 (v/v) de penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% de suero humano autólogo, 1 μM de dexametasona) para la cámara inferior. El día 7, enjuague la cámara inferior con RPMI+ para preparar la cavidad para la siembra de monocitos.
3. Semilla 0,1 x 10⁶ monocitos suspendidos en 200 μL RPMI+ en la cámara inferior.
4. Recolección de monocitos
   1. Lavar las células con 1 mL de PBS (-/-) e incubar durante 7 min a 37 °C en PBS precalentado (-/-) que contenga 4 mg/mL de lidocaína + 5 mM de EDTA a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Recoja las células y centrifugue a 350 x g durante 7 minutos, vuelva a suspender las células en 1 ml de RPMI+ y cuente. Coloque los puertos del biochip hacia abajo para que las células se adhieran a la membrana.

5. Día 8: Perfusión de biochips

1. En este punto, asegúrese de que los biochips estén listos para conectarse al flujo y perfundirse. Antes de iniciar la perfusión, prepare una incubadora vacía y coloque la bomba peristáltica en su interior.
2. Perfusión de los biochips
   1. Antes de conectar el tubo esterilizado al biochip, enjuague el tubo con 200 μL de PBS (+/+), seguido de 200 μL de medio EC. El tubo tiene un diámetro interior de 0,5 mm, que consta de lados más largos (20 cm) y más cortos (12 cm) divididos por dos tapones de bomba peristáltica. Deje el tubo a un lado y prepare los depósitos para el medio.
   2. Realice el intercambio de medios en las cámaras superior e inferior enjuagándolas con el respectivo medio de cultivo celular recién preparado.
   3. Inserte el depósito en el lado de salida del biochip y conecte el depósito con la tubería a la entrada del biochip (Figura 2). Conecte el tubo al depósito y al biochip de modo que haya una perfusión circular del medio entre el depósito y el biochip.
   4. Una vez que todo esté conectado a los puertos, llene el depósito con 500 μL de medio EC. Conecte el biochip con el tubo en una perfusión con un caudal de 21 μL/min (Figura 2). Observar de cerca durante los primeros 15 min de perfusión para la inserción de burbujas. Realizar el intercambio de medios diariamente en ambas cámaras.

6. Día 9 - Día 11: Establecimiento de una interfaz aire-líquido

1. Detenga la perfusión, vacíe los depósitos y vuelva a llenar con medio recién preparado debajo de un gabinete de seguridad estéril. Pipetear 500 μL de medio EC en los depósitos y enjuagar suavemente la cámara inferior con 200 μL de RPMI+. Iniciar de nuevo la perfusión con una tasa de perfusión de 21 μL/min.
2. Interfaz aire-líquido (ALI)
   1. Establecer el ALI desde el día 12 hasta el final del experimento (día 14). Durante el cultivo de ALI, exponga las células epiteliales al aire.
   2. Para establecer el cultivo de ALI, prepare un nuevo medio vascular EC (añadir 1:100 (v/v) de penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/ml de GM-CSF, 20% de suero humano autólogo, 1μM de dexametasona) para mantener todos los tipos de células en el chip. En este punto, el medio contiene una mayor concentración de AS (20%).
   3. Abra los tapones en la cámara inferior debajo de un gabinete de seguridad estéril y absorba cuidadosamente el medio hasta que se vea una burbuja de aire, como se muestra en la Figura 3. Asegúrese de que se haya retirado todo el líquido del canal y de la cámara y cierre los puertos con cuidado.
   4. Llene los depósitos con medio EC (-/-) y continúe el cultivo de perfusión con un caudal de 21 μL/min. Intercambie el medio solo en la cámara superior hasta el día 14 y mantenga las células epiteliales en la cámara inferior solo con aire.

7. Día 14: Recolección y análisis de tejidos

1. Desconecte el biochip del flujo. Conecte el tubo y verifique en el microscopio la confluencia celular. Debido al aire en la cámara inferior, las capas celulares pueden parecer borrosas y difíciles de visualizar. En este punto, el modelo está listo para una mayor experimentación.
2. Fijación y tinción de tejido en biochip
   1. Lave las cavidades con PBS (+/+) para eliminar el medio de cultivo celular. Pipetear 300 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% disuelto en PBS (-/-) en la cámara superior y 200 μL en la cámara inferior e incubar durante 10 min en RT.
      NOTA: Cuando trabaje con productos químicos de fijación como PFA, use una campana extractora. Recoja y elimine los desechos en consecuencia.
   2. Lave las cámaras 3 veces con PBS (+/+). Después de la fijación, almacene los biochips a 4 °C o utilícelos directamente para la tinción con inmunofluorescencia de las células.
   3. Para la permeabilización, pipetea 300 μL de Triton X-100 al 0,25% en PBS (+/+). Incubar durante 30 min en RT.
   4. Después de la incubación, lavar ambas cámaras con PBS (+/+) y pipetear 300 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS (+/+) en ambas cámaras. Incubar durante 1 h en RT.
   5. Mientras tanto, prepare el panel de anticuerpos para la tinción de inmunofluorescencia. Para preparar el panel de anticuerpos para la tinción de inmunofluorescencia, se colocó un tubo con una cantidad suficiente de BSA al 3% para diluir los anticuerpos. Utilice 50 μL de diluciones de anticuerpos para cada membrana. Utilice una proporción de dilución de 1:100 para los paneles de anticuerpos primarios y de 1:200 para los paneles de anticuerpos secundarios. Además, para el panel de anticuerpos secundarios, prepare DAPI en una proporción de dilución de 1:2.000. Para los anticuerpos correspondientes, ver (Tabla 1).
   6. Para acceder directamente a las células dentro del biochip, se debe quitar la lámina de unión. Para abrir las cámaras microfluídicas, haga un corte exacto en el exterior de la cavidad y retire la lámina de unión. Corta la membrana quitando los bordes sellados al biochip con el bisturí.
      NOTA: Trabaje con precisión y exactitud durante este paso para evitar daños en la membrana y lesiones debidas al filo del bisturí.
   7. Después de separar la membrana del biochip, divida la membrana en dos partes. Recoja las piezas de membrana con una pinza y colóquelas en un portaobjetos microscópico para teñirlas.
   8. Pipetear 50 μL de solución de anticuerpos por pieza de membrana. Incubar durante la noche a 4 °C, protegido de la luz.
   9. Después de la incubación, coloque la membrana en 500 μL de PBS (-/-) en una placa de 24 pocillos y lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una en PBS (+/+). Después del lavado, pipetear 50 μL de solución de anticuerpos secundarios e incubar durante 1 h a RT protegido de la luz.
   10. Lave la membrana con PBS (+/+) 3 veces durante 5 minutos cada una. Mientras tanto, prepare y etiquete los portaobjetos microscópicos para el experimento. Coloque una gota de medio de montaje en la corredera y coloque la membrana correspondiente. Repita este paso para todas las membranas. Al final, coloque una gota más del medio de montaje en la parte superior de la membrana y use un cubreobjetos. Conservar a 4 °C.

Resultados

Un examen de las alteraciones morfológicas y la expresión de proteínas marcadoras podría realizarse mediante tinción de inmunofluorescencia. Después de co-cultivar durante 14 días, los lados vascular y epitelial se analizan para la expresión de los marcadores celulares respectivos. Este método es útil para estudiar las interacciones y la integridad de los componentes vasculares y epiteliales, lo cual es esencial para el modelado de enfermedades como una lectura biológica funcional relacionada con la infección...

Discusión

El modelo de alvéolo en chip representa un modelo de tejido multicapa del alvéolo humano, que integra tipos de células esenciales del tracto respiratorio inferior, incluidas las células epiteliales pulmonares, las células endoteliales y los macrófagos, cultivadas en una disposición organotípica en un ALI con perfusión media del revestimiento endotelial. Las células de diferentes capas expresan proteínas marcadoras celulares específicas, como la E-cadherina, una molécula de adhesión dependiente del calcio de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss