Modelo de alvéolo en chip inmunocompetente para el estudio de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar

Resumen

Los modelos de pulmón en chip superan a los cultivos 2D tradicionales al imitar la interfaz aire-líquido y la perfusión de células endoteliales, simulando el flujo sanguíneo y el intercambio de nutrientes cruciales para los estudios de fisiología pulmonar. Esto aumenta la relevancia de la investigación pulmonar, ya que ofrece un entorno dinámico y fisiológicamente preciso para avanzar en la comprensión y el tratamiento de las infecciones respiratorias.

Resumen

Presentamos un modelo avanzado de pulmón en chip inmunocompetente diseñado para replicar la estructura y función alveolar humana. Este innovador modelo emplea un biochip perfundido microfluídicamente que admite una interfaz aire-líquido que imita el entorno en los alvéolos humanos. La ingeniería de tejidos se utiliza para integrar componentes celulares clave, incluidas las células endoteliales, los macrófagos y las células epiteliales, para crear un modelo de tejido representativo del alvéolo. El modelo facilita el examen en profundidad de las respuestas inmunitarias de la mucosa a diversos patógenos, incluidos virus, bacterias y hongos, avanzando así en nuestra comprensión de la inmunidad pulmonar. El objetivo principal de este protocolo es proporcionar detalles para establecer este modelo de alvéolo en chip como una plataforma in vitro robusta para estudios de infección, lo que permite a los investigadores observar y analizar de cerca las complejas interacciones entre los patógenos y el sistema inmunológico del huésped dentro del entorno pulmonar. Esto se logra mediante la aplicación de técnicas basadas en microfluídica para simular las condiciones fisiológicas clave de los alvéolos humanos, incluido el flujo sanguíneo y la estimulación biomecánica de las células endoteliales, junto con el mantenimiento de una interfaz aire-líquido crucial para la exposición realista de las células epiteliales al aire. El sistema modelo es compatible con una serie de ensayos estandarizados, como la tinción de inmunofluorescencia, el perfil de citocinas y el análisis de unidades formadoras de colonias (UFC)/placa, lo que permite obtener información completa sobre la dinámica inmunitaria durante la infección. El alvéolo en chip está compuesto por tipos de células esenciales, incluidas las células epiteliales pulmonares distales humanas (H441) y las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), con macrófagos primarios derivados de monocitos estratégicamente ubicados entre las capas epitelial y endotelial. El modelo de tejido mejora la capacidad de diseccionar y analizar los factores matizados implicados en las respuestas inmunitarias pulmonares in vitro. Como herramienta valiosa, debería contribuir al avance de la investigación pulmonar, proporcionando un modelo in vitro más preciso y dinámico para estudiar la patogénesis de las infecciones respiratorias y probar posibles intervenciones terapéuticas.

Introducción

El pulmón humano tiene un papel notable en la respiración y la defensa inmunitaria, con interacciones complejas entre las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar¹. La capacidad de los alvéolos para crear una respuesta inmunitaria eficiente es vital para prevenir infecciones pulmonares y garantizar la salud pulmonar. Dado que los pulmones están constantemente expuestos a una amplia gama de riesgos potenciales, incluidas bacterias, virus, hongos, alergias y partículas, comprender las complejidades de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar es fundamental para descubrir los mecanismos detrás de las infecciones respiratorias, los tr....

Protocolo

Las células HUVEC se aíslan de los cordones umbilicales y se utilizan hasta el paso 4. Los monocitos primarios se aíslan de donantes sanos a partir de sangre entera. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Universitario de Jena, Jena, Alemania (3939-12/13). De acuerdo con la Declaración de Helsinki, todas las personas que donaron células para el estudio dieron su consentimiento informado.

1. Día 1: Preparación del biochip

1. Los biochips están disponibles en diferentes tamaños y modelos. Para los experimentos aquí, use el modelo BC002. Coloque el biochip en una placa de Petri de vidrio, llene la p....

Discusión

El modelo de alvéolo en chip representa un modelo de tejido multicapa del alvéolo humano, que integra tipos de células esenciales del tracto respiratorio inferior, incluidas las células epiteliales pulmonares, las células endoteliales y los macrófagos, cultivadas en una disposición organotípica en un ALI con perfusión media del revestimiento endotelial. Las células de diferentes capas expresan proteínas marcadoras celulares específicas, como la E-cadherina, una molécula de adhesión dependiente del calcio de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss